宋尚新，肖紅梅，高 峰，周光宏*，邱良焱

(南京農(nóng)業(yè)大學 教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質量控制重點開放實驗室，江蘇 南京 210095)

轉基因稻米DNA提取方法的比較研究

宋尚新，肖紅梅，高 峰，周光宏*，邱良焱

(南京農(nóng)業(yè)大學 教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質量控制重點開放實驗室，江蘇 南京 210095)

目的：建立一種以水稻種子為原料，簡便、快速、有效的基因組DNA提取方法，作為轉基因稻米的PCR檢測基礎。方法：選擇傳統(tǒng)的CTAB 法、改良的堿處理法、高溫水煮法，以轉基因糙米、非轉基因糙米、轉基因精米為材料提取DNA，并對提取物進行檢測。結果：改良的堿處理法提取的DNA模板的完整性、純度和PCR反應方面與傳統(tǒng)CTAB法相近，且比CTAB法的產(chǎn)率高、耗時短、成本低。結論：改良的堿處理法可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的CTAB法用于轉基因稻米檢測中DNA模板的制備。

水稻；DNA提??；改良的堿處理法；轉基因檢測

水稻是我國的主要糧食作物，占我國糧食總產(chǎn)的40%[1]，我國在轉基因水稻的培育方面進行了大量的探索和研究，已培育出大量抗蟲、抗病、抗除草劑轉基因水稻[2-5]，其中一些已通過環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗階段[6]，然而近年國內(nèi)外非法轉基因水稻污染事件時有發(fā)生，因此建立有效的轉基因成分檢測方法迫在眉睫，而DNA提取是進行轉基因檢測的前提。在以往的研究中大多數(shù)學者以水稻新鮮葉片或發(fā)芽幼苗作為提取DNA的材料[7-11]，研究表明直接利用水稻種子提取DNA是可行的。李穩(wěn)香等[12]采用高溫水煮法提取整粒水稻種子的基因組DNA，用于雜交水稻種子純度的SSR(simple sequence repeat)指紋圖譜標記鑒定。李娟等[13]采用改良的CTAB (cetyl triethl ammonium bromide)法提取單粒糙米中DNA，與從嫩葉中提取的DNA相比，其質量無明顯差異。本研究以糙米和精米為材料，選擇傳統(tǒng)CTAB法、改良的堿處理法和高溫水解法提取DNA，并對提取物進行瓊脂糖凝膠電泳和PCR(polymerase chain reaction)擴增比較分析，旨在得到一種可以直接以水稻種子為材料、簡便、快速、有效的基因組DNA提取方法，為后續(xù)研究含轉基因稻米的飼料及食品的定性和定量檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與分組

轉基因水稻：香125S/Bar68-1雜交稻，被轉入的外源基因包括CaMV35S(cauliflower mosaic virus 35S)啟動子、Bar(bialaphos resistance gene)基因、NOS(nopaline synthase gene)終止子；非轉基因水稻：香125S/D68非轉基因水稻 中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所。

將水稻種子加工成糙米和精米，并充分研磨成粉狀。設立3種樣品，分別為轉基因糙米、非轉基因糙米和轉基因精米，每種樣品分別采用3種方法提取DNA，共9個處理，每個處理6個重復。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法

CTAB法：參照GB/T 19495.3—2004《轉基因產(chǎn)品檢測核酸提取純化方法》中的CTAB-1法。

改良的堿處理法：參照朱世楊等[9]方法，有改進。稱取20mg樣品置于1.5mL離心管中，加入200μL 0.25mol/L NaOH溶液，水浴95℃ 20s處理；加入150μL 0.25mol/L HCl溶液和150μL 0.5mol/L Tris-HC1(pH=8)，水浴85℃處理3min，8000r/min離心5min，上清液可作PCR模板。

高溫水煮法：參照朱世楊等[9]方法，有改進。稱取20mg樣品置于1.5mL離心管中，加入100mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)、1mol/L KCl、10mmol/L EDTA各200μL，水浴95℃處理8min，8000r/min離心5min，上清液可作PCR模板。

1.2.2 DNA提取物的檢測

1.2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測

用超純水將3種方法提取的DNA模板稀釋到50ng/μL，吸取5μL DNA與1μL上樣緩沖液混勻，在1.0%的瓊脂糖凝膠上85V電泳20min，在熒光成像儀上觀察和拍照。

1.2.2.2 DNA質量濃度和純度的測定

用Thermo Scientific NANODROP 1000分光光度計檢測3種方法提取的DNA模板的質量濃度和純度。其中DNA純度決定于A260nm/A280nm的大??；DNA質量濃度由DNA模板在260nm的吸光度決定，A260nm=1相當于DNA質量濃度為50ng/μL[14]。DNA產(chǎn)率的大小按照下式計算：

1.2.3 PCR擴增反應

選擇水稻內(nèi)源基因SPS(sucrose phosphate synthase)基因，外源基因CaMV35S啟動子和NOS終止子進行PCR擴增，各基因的引物序列[15]見表1。

25μL反應體系：12.5μL PCR預混液，10μmol/L的上下游引物各1μL，50ng/μL的模板DNA 2μL，加無菌水補齊至25μL。

表1 引物序列及片段大小Table1 Sequence and fragment length of primers

擴增條件：SPS：預變性94℃ 5min；變性 94℃1min，退火 56℃ 40s，延伸 72℃ 40s，40個循環(huán)；72℃延伸7min。CaMV35S、NOS：預變性94℃ 5min；變性 94℃ 30s，退火 56℃ 30s，延伸 72℃ 1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0單因素方差分析和Duncan氏法多重比較進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 DNA提取物檢測

2.1.1 DNA提取物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

圖1 DNA提取物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted by different methods

由圖1可見，高溫處理法中的條帶呈現(xiàn)明顯的彌散形，拖尾現(xiàn)象較嚴重；CTAB法呈現(xiàn)出清晰整齊的條帶，無拖尾現(xiàn)象；改良的堿處理法條帶清晰整齊，無拖尾現(xiàn)象，與CTAB法相近；3種方法均具有一定程度的RNA污染。

2.1.2 DNA提取物產(chǎn)率和純度檢測結果

圖2顯示了3種提取方法的DNA產(chǎn)率。改良的堿處理法和高溫水煮法的DNA產(chǎn)率均極顯著高于CTAB法(P＜0.01)。高溫水煮法用于非轉基因糙米和轉基因精米的DNA產(chǎn)率極顯著高于改良的堿處理法(P＜0.01)，用

于轉基因糙米的產(chǎn)率變化不顯著(P＞0.05)。同時由表2可知，高溫水煮法得到的DNA的質量濃度大于60ng/μL，改良的堿處理法大于50ng/μL，CTAB法大于20ng/μL，均可以作為PCR反應的模板。

圖2 不同DNA提取方法的DNA產(chǎn)率比較Fig.2 Comparison on the yield of DNA extracted by different methods

圖3 不同DNA提取方法的A260/A280比較Fig.3 Comparison on A260/A280of DNA extracted by different methods

表2 3種提取方法所得DNA的質量濃度、純度及PCR陽性擴增結果Table2 Mass concentration, purity and PCR positive amplification results of DNA extracted by three extraction methods

圖3顯示了3種提取方法的A260nm/A280nm的比值。純DNA 的A260nm/A280nm約為1.8，大于1.8表明有RNA污染，小于1.8表明有蛋白質污染[16]。CTAB法的A260nm/A280nm在1.86～2.15之間，極顯著高于改良的堿處理法和高溫水煮法(P＜0.01)。高溫水煮法的A260nm/A280nm在1.70～1.88之間，顯著高于改良的堿處理法(P＜0.05)，改良的堿處理法的A260nm/A280nm在1.48～1.71之間(表2)。

2.2 PCR擴增結果

圖4 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products

由圖4a和圖4b可見，3種方法均能較好的擴增出35S啟動子和NOS終止子，條帶清晰整齊。由圖4c可見，CTAB法和改良的堿處理法能較好擴增SPS基因，高溫水煮法擴增結果較差。由表2中PCR陽性結果與總數(shù)的比值可知，CTAB法的比值為39/43，即為90.7%；改良的堿處理法的比值為40/46，即為87.0%；高溫水煮法的比值為34/42，即為81.0%。

3 討 論

我國在轉基因水稻的培育方面進行大量的研究，2009年底我國有2種轉基因水稻獲得農(nóng)業(yè)部的安全認證，即將進入商業(yè)化生產(chǎn)階段[17]，由此轉基因水稻的

安全性也越來越受到人們的關注，且近年國內(nèi)外的非法轉基因水稻污染事件時有發(fā)生，如2006年在香港及廣州市場發(fā)現(xiàn)亨氏嬰兒營養(yǎng)米粉中含有非法轉基因水稻成分；廣州百佳超市所售散裝大米被查出含有轉基因水稻成分[18]。因此建立食品鏈中轉基因成分的檢測方法已經(jīng)成為轉基因稻米安全研究的熱點，而提取稻米基因組DNA是轉基因稻米基因檢測的前提，目前常用的植物基因組DNA提取方法有傳統(tǒng)的CTAB法，簡易提取法中的堿處理法、高溫水煮法等。傳統(tǒng)的CTAB法提取的DNA質量較高，但具有成本高、毒性大、操作煩瑣耗時等缺點，而簡易提取法大都速度快、成本低，但是DNA提取物的質量較差，保存時間短，PCR 擴增效果差。本研究以傳統(tǒng)CTAB法為對照，對以往研究中的堿處理法進行改良，以期在保證簡易法經(jīng)濟、簡單、快捷優(yōu)點的基礎上，提高D NA模板的質量。

在轉基因食品的生產(chǎn)實踐及海關檢驗中，往往要求經(jīng)濟、簡單、快捷的DNA提取方法。本實驗中，CTAB法需要消耗至少160min，高溫水煮法需要13min，而改良的堿處理法最快，只需要9min，且改良的堿處理法需要的試劑少、步驟簡單、實驗條件易實現(xiàn)。因此改良的堿處理法與傳統(tǒng)CTAB法相比，具有經(jīng)濟、簡單、快捷等優(yōu)點，更適合在實際生產(chǎn)和檢驗中應用。

由于植物細胞具有細胞壁，要想得到DNA首先必須裂解細胞壁，因此細胞裂解是植物基因組DNA提取最關鍵的步驟。裂解時間和裂解溫度是影響裂解效果的重要因素，溫度過高時間過長會使DNA降解加劇，從而影響DNA的完整性，時間過短溫度過低，則裂解不充分，從而降低得率。實驗中高溫水煮法的裂解條件為水浴95℃處理8min，DNA的得率最高，但其瓊脂糖凝膠電泳圖譜呈明顯的彌散形，表明其DNA發(fā)生較大程度的降解，這與Vanni等[19]、Collard等[11]的研究結果類似。CTAB法裂解條件為水浴65℃處理30min，裂解條件較溫和，且因其步驟繁多，在純化過程中也會損失掉一部分DNA，因此得率最低，但瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示其DNA較完整。改良的堿處理法的裂解條件為水浴85℃處理3min，與朱世楊等[9]的方法相比，將裂解溫度降低了15℃，其DNA得率雖然低于高溫水煮法，但仍然遠遠高于CTAB法，由瓊脂糖凝膠電泳結果可見，其DNA完整性與CTAB法相近，明顯優(yōu)于高溫水煮法。因此改良的堿處理法不但比傳統(tǒng)CTAB法的DNA得率高，且完整性較好。

同時由瓊脂糖凝膠電泳結果可見，3種提取方法得到的DNA模板都含有一定程度的RNA污染，可以通過添加RNA酶去除。本實驗中的CTAB法對樣品進行了一次RNA酶處理，而高溫水煮法和改良的堿處理法沒有進行RNA酶處理，因此RNA污染較CTAB法多，但是提取成本和時間減少了，因此可以根據(jù)實驗的需求考慮是否使用RNA酶處理。

不同提取方法得到的DNA模板在相同反應條件下同時擴增，其PCR結果與模板的優(yōu)劣具有直接相關性。由于SPS基因是轉基因水稻檢測中的內(nèi)標基因[20]，而35S啟動子和NOS終止子是轉基因植物中最常出現(xiàn)的外源基因，本實驗選擇這3種基因進行PCR擴增，結果都表明3種方法在200bp以下的片段都能得到很好的擴增，但是改良的堿處理法和高溫水煮法的條帶都不如CTAB法的亮，究其原因，可能與不同方法得到的產(chǎn)物的純度不同有關，由于堿處理法和高溫水煮法的DNA產(chǎn)物沒有經(jīng)過純化，與CTAB法相比，其中可能含有較多的P C R抑制劑，如多糖、蛋白質、酚類等。由SPS基因的擴增結果及表2可知，與CTAB法和改良的堿處理法相比，高溫水煮法不能很好的擴增大片段的基因，其擴增效率為81.0%，進一步說明高溫水煮法得到的DNA產(chǎn)物降解較嚴重。而改良的堿處理法的SPS擴增為87.0%與CTAB法的90.7%相差較小。因此改良的堿處理得到的DNA模板能進行較好的PCR反應。

另外，實驗選擇糙米和精米作為材料，由實驗結果可以看出兩種材料之間具有一定的差異。由圖2可見，3種提取方法的精米的DNA得率明顯小于糙米，同時由圖3可見，精米的DNA純度優(yōu)于糙米，分布在1.7～2.0之間，可能因為精米在完全去皮后，其基因組DNA含量少于糙米，且雜質也減少了，從而使得從精米中提取的DNA得率少于糙米，而純度高于糙米。許文濤等[21]研究表明PCR抑制因子主要存在于米麩中，提取樣品中只要含有米麩，PCR反應就被完全抑制，而用精米提取的基因組DNA作為模板時，則不發(fā)生任何PCR抑制現(xiàn)象。由本實驗中的表2可以看出，來自精米的DNA其PCR陽性結果與總數(shù)的比值比糙米高，與許文濤等[21]的研究結果相似。

綜上所述，本實驗對朱世楊等[9]用于提取水稻葉片DNA的堿處理法進行改良，將改良的堿處理法直接應用于糙米和精米，以傳統(tǒng)CTAB法為對照，改良的堿處理法不僅經(jīng)濟、簡單、快捷，且其DNA模板的完整性、純度、PCR反應質量得到明顯提高。

4 結 論

改良的堿處理法提取的DNA模板在完整性、純度和PCR反應3個方面與傳統(tǒng)CTAB法相近，且比CTAB法的產(chǎn)率高、耗時短、成本低、操作簡單。因此改良的堿處理法可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的CTAB法用于轉基因稻米檢測中DNA模板的制備。

[1]OECD. Consensus document on compositional considerations for new varieties of rice (Oryza sativa): key food and feed nutrients and antinutrients[R]. Paris: OECD, 2004.

[2]曉云, 黃昆侖, 秦偉, 等. 轉基因水稻食用安全性評價國內(nèi)外概況[J].食品科學, 2008, 29(12): 760-765.

[3]CHEN Hao, LIN Yongjun, ZHANG Qifa. Review and prospect of transgenic rice research[J]. Chinese Science Bulletin, 2009, 54: 4049-4068.

[4]XIAO Guoying, YUAN Longping, SUN S S M. Strategy and utilization of a herbicide resistance gene in two-line hybrid rice[J]. Mol Breeding, 2007, 20: 287-292.

[5]王麗冰, 劉立軍, 顏亨梅. 轉Bt抗蟲基因水稻的研究進展和生物安全性及其對策[J]. 生命科學研究, 2009, 13(2): 182-188.

[6]蔣建科. 轉基因水稻能不能放心吃[N]. 人民日報, 2009-12-25(5).

[7]IKEDA N, BAUTISTA N S, YAMADA T. Ultra-Simple DNA Extraction method for marker-assisted selection using microsatellite markers in rice[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 2001, 19: 27-32.

[8]WU Gang, WU Yuhua, NIE Shujing, et al. Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1[J]. Food Chemistry, 2010, 119: 417-422.

[9]朱世楊, 羅天寬, 張小玲, 等. 8種水稻基因組DNA提取方法的比較[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2009, 37(5): 1929-1931.

[10]趙紅霞, 謝攀, 黃志堅, 等. 一種改良的水稻總DNA提取方法[J]. 湖北大學學報: 自然科學版, 2006, 28(4): 389-392.

[11]COLLARD B C Y, DAS A, VIRK P S, et al. Evaluation of quick and dirty DNA extraction methods for marker-assisted selection in rice (Oryza sativa L.)[J]. Plant Breeding, 2007, 126: 47-50.

[12]李穩(wěn)香, 詹慶才. 雜交水稻種子純度SSR指紋圖譜標記鑒定技術研究[J]. 中國種業(yè), 2006(3): 21-22.

[13]李娟, 文建成, 譚學林. 從水稻單粒糙米中快速制備基因組DNA的方法[J]. 分子植物育種, 2007, 5(5): 735-737.

[14]CHAPELA M J, SOTELO C G, PEREZ-MARTIN R I, et al. Comparison of DNA extraction methods from muscle of canned tuna for species identification[J]. Food Control, 2007, 18: 1211-1215.

[15]王小琦, 張名昌, 任志強, 等. 轉基因水稻定性 PCR檢測體系的建立[J]. 中國糧油學報, 2008, 23(6): 202-205.

[16]SHARMA A D, GILL P K, SINGH P. DNA isolation from dry and fresh samples of polysaccharide-rich plants[J]. Plant Mol Biol Rep, 2002, 20: 415a.

[17]劉志偉, 范敬群. 轉基因水稻安全性經(jīng)過多個角度驗證[N]. 科技日報, 2010-01-07(1).

[18]孫杰. 亨氏轉基因米粉驚現(xiàn)港穗[N]. 華夏時報, 2006-04-04(B07).

[19]VANNI A, ANFOSSI L, GIOVANNOLI C, et al. Evaluation of purification procedures of DNA from maizemeal samples by exploiting different analytical techniques for the assessment of DNA quality[J]. Ann Chim, 2004, 94: 269-280.

[20]AGRIC J. International collaborative study of the endogenous reference gene, sucrose phosphate synthase(SPS), used for qualitative and quantitative analysis of genetically modified rice[J]. Food Chem, 2009, 57: 3525-3532.

[21]許文濤, 黃昆侖, 鄧愛科, 等. 稻米中PCR抑制因子抑制機理的研究[J]. 食品科學, 2009, 30(15): 148-151.

Comparison of DNA Extraction Methods for Transgenic Rice

SONG Shang-xin，XIAO Hong-mei，GAO Feng，ZHOU Guang-hong*，QIU Liang-yan
(Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Objective: To establish a simple, fast and effective DNA extraction method from transgenic rice. Methods: DNA extraction methods including traditional CTAB method, improved alkali-treated method and boiling-treated method for DNA extraction from transgenic brown rice, non-transgenic brown rice and transgenic milled rice were compared to screen the optimal extraction method. Results: The integrity, purity and PCR result of template DNA extracted by improved alkali-treated method were similar with the DNA extracted by traditional CTAB method. Meanwhile, compared with traditional CTAB method, improved alkali-treated method had higher DNA extraction rate, less consuming time and lower cost. Conclusion: Improved alkalitreated method can replace traditional CTAB method as DNA extraction method for the detection of transgenic rice.

rice；DNA extraction；improved alkali-treated method；detection of transgene

S511

A

1002-6630(2010)22-0445-05

2010-03-05

轉基因生物新品種培育科技重大專項(2009ZX08012-014B)

宋尚新(1987—)，女，碩士研究生，主要從事動物營養(yǎng)與畜產(chǎn)品品質研究。E-mail：2008105069@njau.edu.cn

*通信作者：周光宏(1960—)，男，教授，博士，主要從事肉品質量安全控制研究。E-mail：ghzhou@njau.edu.cn