黃洪勇，王金寶，李恒芬，錢東麗#，師天元，郭新勝（.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng)市45300；.河南省生物精神病學(xué)重點實驗室，新鄉(xiāng)市 45300）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為抑郁癥的發(fā)病與遺傳因素、神經(jīng)遞質(zhì)、軀體、心理和性別等因素有關(guān)[1，2]。米氮平（Mirtazapine，MTZ）為全球首個去甲腎上腺素能和特異性5-羥色胺能抑制劑，具有獨特的雙重抗抑郁藥理學(xué)特性，有起效快、療效確切、耐受性好、無抗膽堿能作用等優(yōu)點，目前己廣泛應(yīng)用于臨床[3，4]。國外曾以監(jiān)測患者體內(nèi)米氮平的血藥濃度來指導(dǎo)臨床用藥、預(yù)警不良反應(yīng)和規(guī)避風險[5]。本試驗建立了反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定人血漿中米氮平的濃度，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜儀系統(tǒng)，包括G1311A自動調(diào)配泵、G1316A可調(diào)柱溫恒溫箱、G1322A在線脫氣、色譜化學(xué)工作站（美國Agilent公司）；XT-120A電子分析天平（瑞士Precisa公司）；LXJ-Ⅱ離心沉淀機（上海醫(yī)分儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

米氮平對照品（無錫華裕生物制藥有限公司，批號:080428，含量:99.6%）；內(nèi)標:氯氮平對照品（美國Sigma公司，批號:010K1204）；甲醇為色譜純，正丁胺、乙酸乙酯、乙醚為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:美國Diamonsil?（250 mm×4.6 mm，5 μm）C18反相柱；柱溫:25 ℃；流動相:甲醇-0.3%正丁胺溶液（80∶20）；流速:1.0 mL·min－1；檢測波長:292 nm；進樣量:20 μL。 在該色譜條件下，色譜峰與血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)峰很好分離，無干擾峰出現(xiàn)，米氮平和內(nèi)標保留時間分別為6.59、8.07 min，主峰米氮平的有效塔板數(shù)應(yīng)在9 500以上，分離度7.3，拖尾因子1.04。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制備

取米氮平對照品約10 mg，準確稱定，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，即得。于冰箱4℃保存?zhèn)溆?，臨用前用甲醇稀釋成所需濃度。另同法制備出濃度為10 μg·mL－1氯氮平的甲醇溶液為內(nèi)標溶液。

2.3 血漿樣品處理

取400 μL含藥血漿加至10 mL具塞錐形玻璃離心管中，加入內(nèi)標溶液100 μL，渦旋振蕩1 min，加入提取劑乙酸乙酯-乙醚（1∶1）1 mL，渦旋振蕩提取2 min，4 000 r·min－1離心10 min，取上層提取液置于一干燥具塞尖底試管中，再加入1 mL上述提取劑，同法操作。振蕩混合2次提取液，40℃水浴氮氣吹干，殘渣用100 μL流動相復(fù)溶后，4 000 r·min－1離心10 min，取上清液20 μL進樣。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察:取空白血漿300 μL共8份，分別加入不同濃度的米氮平對照品溶液100 μL，使血漿中藥物濃度分別為0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 μg·mL－1，振蕩混勻，然后按“2.3”項下方法處理，進樣測定并記錄色譜。以米氮平血藥濃度（X）對米氮平峰面積與內(nèi)標峰面積的比值（Y）進行線性回歸，得標準曲線方程為Y＝0.267X+0.031（r＝0.999 9，n＝8），結(jié)果表明，米氮平血藥濃度在0.1～20.0 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。當信噪比（S/N）＝3時，最低檢測限為0.05 μg·mL－1。

2.4.2 方法回收率及精密度試驗:取空白血漿3份，分別制備成濃度各為1.0、4.0、16.0 μg·mL－1的米氮平血漿對照品溶液，然后按“2.3”項下方法處理。每種濃度日內(nèi)平行測定5次，3種濃度隔日測定1次，各5次。分別計算日內(nèi)、日間精密度，并根據(jù)同一天內(nèi)低、中、高3種濃度血漿對照品測定結(jié)果計算相對回收率；另制備濃度各為1.0、4.0、16.0 μg·mL－1對照品溶液并分別進樣5次，以此為標準，計算米氮平的絕對回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果（n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision test（n＝5）

2.4.3 穩(wěn)定性試驗:各制備低、中、高（1.0、4.0、16.0 μg·mL－1）3種濃度的米氮平血漿樣品，于－20℃冰箱保存，分別在0、5、10、15、20 d時取出于37.5℃水浴融化后，按“2.3”項下方法處理，測定濃度。結(jié)果濃度變化的RSD＝4.85%，表明米氮平在血漿中至少放置20 d穩(wěn)定。

2.4.4 患者血樣含量測定:取患者上肢靜脈血5 mL，取出血漿，平行處理3份（編號:MTZ-1、MTZ-2、MTZ-3），避光低溫保存至測定?；颊叩难獦訙y定結(jié)果見表2。

表2 患者的血樣測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of the determination of plasma sample of patients（n＝3）

由表2可以看出，RP-HPLC法測定血漿中米氮平的濃度，重復(fù)性比較好，RSD值均＜2%。

3 討論

筆者曾結(jié)合文獻[6，7]，系統(tǒng)比較了乙醚與乙酸乙酯的提取效率，發(fā)現(xiàn)二者相差不大，但乙酸乙酯作為提取劑非常不易揮散，氮氣吹干較難。本試驗選用了復(fù)合提取劑，既保持了較高的提取效率，又減少了工作量。

抑郁癥患者在藥物治療上大多聯(lián)用了一些情緒穩(wěn)定劑（如卡馬西平）、鎮(zhèn)靜劑（如地西泮），因此，這些物質(zhì)不易作為內(nèi)標的首選。本試驗選用了抑郁癥患者不常聯(lián)用的氯氮平作為內(nèi)標，避免了患者血樣本身對分析過程的影響，擴大了方法現(xiàn)實應(yīng)用中的范圍。

在有關(guān)米氮平含量的體內(nèi)分析方法中，熒光檢測法和毛細管電泳法樣品前處理復(fù)雜[8，9]、液相色譜-單四極桿質(zhì)譜法儀器昂貴[10]、其他高效液相色譜法則分析時間過長[6]，均遠不能適應(yīng)人體內(nèi)米氮平的快速、準確分析。本試驗采用的RP-HPLC法具有樣品前處理簡單、分析儀器普及率高、簡便、快速、準確、靈敏等優(yōu)點，適用于米氮平的臨床藥動學(xué)研究和不良反應(yīng)監(jiān)測。

（致謝:本研究在河南省生物精神病學(xué)重點實驗室（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院）完成）

[1]Hatzinger M，Hemmeter UM，Brand S，et al.Electroencephalographic sleep profiles in treatment course and long term outcome of major depression:association with DEX/CRH test response[J].J Psychiatr Res，2004，38（5）:453．

[2]李恒芬.5-HT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)SNPs與心境障礙[D].中南大學(xué)博士論文，2008:36．

[3]Sarchiapone M，Amore M，De Risio S，et al.Mirtazapine in the treatment of panic disorder:an open label trial[J].Int Clin Psychopharmacol，2003，18（1）:35．

[4]Zoccali R，Muscatello MR，Cedro C，et al.The effect of mirtazapine augmentation of clozapine in the treatment of negative symptoms of schizophrenia:a double blind，placebo controlled study[J].Int Clin Psychopharmacol，2004，19（2）:71．

[5]Romiguieres T，Pehourcq F，Matoga M，et al.Determination of mirtazapine and its demethyl metabolite in plasma by high performance liquid chromatography with ultraviolet detection Application to management of acute intoxication[J].Journal of Chromatography B，2002，775（2）:163．

[6]溫預(yù)關(guān)，王玲芝，劉學(xué)軍，等.反相高效液相色譜法測定人血漿中米氮平的濃度[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24（2）:78.

[7]黃洪勇，職曉燕，錢東麗，等.國產(chǎn)與進口富馬酸奎的平片的藥動學(xué)比較及相對生物利用度[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24（10）:612．

[8]尹政元，包麗昕，袁 藝.國產(chǎn)米氮平片人體生物等效性研究[J].中國傷殘醫(yī)學(xué)，2007，15（6）:27．

[9]Labat L，Dallet P，Kummer E，et al.Spectrophotometric HPLC and CZE determination of mirtazapine in pharmaceutical tablets[J].J Pharm Biomed Anal，2002，28（2）:365.

[10]Li RS，Ding L，Jian LH，et al.Determination of mirtazapine in human plasma by HPLC-MS and bioavailability of newly developed mirtazapine tablets in healthy volunteers[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2004，13（3）:171．