陳 柳,劉光清,宋 毅,3,倪 征,余 斌,華炯鋼,李雙茂,云 濤*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部病毒學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州310021;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海200241;3.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華321004)

杯狀病毒(Caliciviruses)呈球形或近球形,直徑30 nm～35 nm,無(wú)囊膜,核衣殼呈二十面體對(duì)稱(chēng)。杯狀病毒科病毒包括4個(gè)屬,分別為兔病毒屬(Lagovirus),代表種為兔病毒性出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV);諾瓦病毒屬(Norovirus),代表種為諾瓦克病毒(Norwalk virus,NoV);扎幌病毒屬(Sappovirus),代表種為扎幌病毒(Sapporovirus)及水皰疹病毒屬(Vesivirus),以豬水皰疹病毒(Vesicular exanthema of swine virus,VESV)為代表種。杯狀病毒的基因組結(jié)構(gòu)很相似,基因組長(zhǎng)約7.4 kb～7.7 kb,含有2個(gè)～4個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF),其中,Ⅱ和Ⅲ型扎幌病毒和RHDV含有2個(gè)ORF(ORF1、ORF2),Ⅰ型、Ⅳ型和Ⅴ型扎幌病毒、諾瓦克病毒和貓杯狀病毒含有3個(gè)ORF(ORF1、ORF2、ORF3),在南安普頓病毒(Southampton virus,SV)基因組中還發(fā)現(xiàn)了ORF4,位于ORF2和ORF3之間。雖然ORFs組成不同,但編碼出的結(jié)構(gòu)蛋白都僅有衣殼蛋白和次結(jié)構(gòu)蛋白兩種。除了全長(zhǎng)基因組以外,在杯狀病毒顆粒中還有許多豐富的亞基因組mRNA分子,其大小約2.2 kb～2.4 kb。亞基因組中含有衣殼蛋白的編碼序列,可以翻譯出具有自聚合能力的衣殼蛋白。不同杯狀病毒的衣殼蛋白具有較高的氨基酸序列同源性,尤其在氨基端和羧基端,且在衣殼蛋白中都含有一個(gè)大約250個(gè)氨基酸的保守序列,該區(qū)域在病毒的復(fù)制或病毒顆粒裝配中發(fā)揮重要作用[1]。杯狀病毒衣殼蛋白不僅在病毒裝配、病毒免疫、而且在病毒識(shí)別、侵入宿主過(guò)程中起著重要的作用。

杯狀病毒科病毒具有較廣的宿主范圍,能引起多種動(dòng)物和人類(lèi)疾病。侵入宿主細(xì)胞是病毒進(jìn)行感染的首要環(huán)節(jié),杯狀病毒首先需要與受體結(jié)合,之后通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。由于該科病毒除水皰疹病毒屬的VESV、貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)和圣米吉爾海獅病毒(San Miguel sea-lion virus,SMSV)外,沒(méi)有很好的體外培養(yǎng)體系,制約了對(duì)該科病毒的研究。關(guān)于杯狀病毒受體的研究,目前只在少數(shù)幾個(gè)種屬中取得了一定進(jìn)展。

1 碳水化合物受體

1.1 組織血型抗原

杯狀病毒科的很多病毒能夠識(shí)別宿主細(xì)胞和組織的血型抗原,包括A、B、H和Lewis型組織血型抗原(HBGAs)。RHDV能識(shí)別成年兔體上呼吸道及消化道上皮細(xì)胞表面的HBGAs-H2,病毒識(shí)別并結(jié)合HBGAs從而啟動(dòng)病毒對(duì)機(jī)體的入侵,而L-巖藻糖是RHDV病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)識(shí)別HBGAs的最基本結(jié)構(gòu)[2-3]。杯狀病毒中與HBGAs結(jié)合研究的比較透徹的是人諾瓦克病毒,曾玫等寫(xiě)了較為詳盡的綜述[4]。Marionneau S等[5]首次報(bào)道重組諾瓦克病毒樣顆粒(rNoVVLPs)可識(shí)別Se+人體胃十二指腸上皮細(xì)胞的H1和H3/4抗原,Huang P等[6]研究了不同諾瓦克病毒毒株衣殼蛋白與人唾液HBGAs的結(jié)合情況,發(fā)現(xiàn)不同毒株識(shí)別不同的HBGAs,目前至少發(fā)現(xiàn)了4種結(jié)合模式,其中3種模式的NoVs(VA387、NV和MOH)識(shí)別分泌型血型組織抗原,而另一種NoV(VA207)識(shí)別Lewis陽(yáng)性的非分泌型。Tan M等[7]通過(guò)多序列比對(duì)、同源模擬、及對(duì)NoV衣殼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,初步確定P2區(qū)袋狀樣結(jié)構(gòu)與HBGAs結(jié)合有關(guān),結(jié)合袋底部包含一個(gè)保守的RGD/K樣motif和3個(gè)環(huán)繞四周的特異氨基酸位點(diǎn),且不同毒株的這些位點(diǎn)不同(VA387株為N302、T337、Q375;MOH株為N302、N338、E378),定點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)進(jìn)一步證實(shí)以上4個(gè)位點(diǎn)對(duì)病毒與受體結(jié)合有重要作用。Tan M等[8]又進(jìn)一步用3種不同結(jié)合模式的NoVs病毒株(NV、VA387和MOH)證實(shí)完整的P區(qū)對(duì)于病毒與HBGAs特異性結(jié)合是必要的,研究發(fā)現(xiàn)P區(qū)獨(dú)立表達(dá)時(shí)雖不能形成VLPs,但可形成二聚體,其與HBGAs結(jié)合模式和完整病毒衣殼相同;相反,S區(qū)能形成小的薄層VLPs,但不與A、B或H HBGAs結(jié)合。Tan M等[9]進(jìn)一步研究了P區(qū)構(gòu)象對(duì)受體親和性的影響,發(fā)現(xiàn)P區(qū)鉸鏈結(jié)構(gòu)的存在與否起著至關(guān)重要的作用,如果VA387 P區(qū)含鉸鏈結(jié)構(gòu)時(shí)主要形成二聚體,與HBGAs親和性較低,一旦P區(qū)鉸鏈結(jié)構(gòu)去除形成T=1的二十面體P粒子,其受體親和力較P二聚體增強(qiáng)至少700倍,可與VLP相比。

1.2 唾液酸

對(duì)于杯狀病毒細(xì)胞受體的研究,主要集中于能在體外進(jìn)行高滴度培養(yǎng)的FCV。Kreutz L C等[10]發(fā)現(xiàn)FCV對(duì)氯奎比較敏感,提示酸化環(huán)境是病毒感染細(xì)胞所必需的。之后,Stuart A D等[11]進(jìn)一步證實(shí),FCV經(jīng)內(nèi)涵素介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用感染細(xì)胞,且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的酸化環(huán)境有利于病毒基因組脫殼后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。又有研究發(fā)現(xiàn)用蛋白酶處理Crandell-Reese貓腎細(xì)胞系(crandell-reese feline kidney,CRFK)能夠增加FCV與之結(jié)合,而磷酸酯酶對(duì)FCV與細(xì)胞結(jié)合沒(méi)有任何影響。相反,預(yù)先用神經(jīng)氨酸苷酶處理,之后用O-寡糖酶處理的細(xì)胞與病毒結(jié)合能力大大減弱。這些研究表明,FCV的細(xì)胞受體含有功能重要的碳水化合物組分[12]。Stuart A D等[13]通過(guò)化學(xué)試劑和酶處理對(duì)宿主細(xì)胞表面某些成分進(jìn)行阻斷,發(fā)現(xiàn)FCV能夠識(shí)別細(xì)胞表面一種N-連接糖基化蛋白的α2,6-唾液酸糖基成分。近幾年來(lái),發(fā)現(xiàn)鼠諾瓦克病毒(Murine norovirus-1,MNV-1)能夠很好地在鼠巨噬細(xì)胞及樹(shù)狀突細(xì)胞中增殖,基于該病毒體外培養(yǎng)模型,Taube S等[14]對(duì)MNV-1的細(xì)胞受體進(jìn)行了初步探討,研究發(fā)現(xiàn),用唾液酸結(jié)合物凝集素以及神經(jīng)氨酸酶處理能減少Ⅰ型鼠諾瓦克病毒(MNV-1)對(duì)鼠巨噬細(xì)胞的感染,說(shuō)明唾液酸在MNV-1的吸附與感染宿主中起著重要的作用。因?yàn)橥僖核崮芪缴窠?jīng)節(jié)苷脂等糖脂,作者進(jìn)一步探討了鼠巨噬細(xì)胞表面存在的3種神經(jīng)節(jié)苷脂(GD1a,GM1和唾液酸基缺乏的GM1(GA1))在MNV-1感染巨噬細(xì)胞中的作用,結(jié)果表明,MNV-1只能結(jié)合GD1a而不與另外兩種神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合,用葡糖基神經(jīng)酰胺酶合成酶抑制劑(D-thero-P4)處理巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)MNV-1對(duì)處理之后的細(xì)胞的感染能力下降,而向培養(yǎng)的該細(xì)胞中加入GD1a能恢復(fù)MNV-1對(duì)該巨噬細(xì)胞的感染。這些現(xiàn)象對(duì)其它的兩株病毒株也同樣適用。以上研究說(shuō)明MNV能用巨噬細(xì)胞表面位于神經(jīng)節(jié)苷脂末端的唾液酸作為細(xì)胞受體。

1.3 硫酸乙酰肝素

Tamura M以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得的NoV病毒樣顆粒VLPs為材料,對(duì)NoV VLPs與細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素的結(jié)合特性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)肝素和蘇拉明(一種高度硫酸化的尿素衍生物)能有效地阻斷VLPs與哺乳細(xì)胞表面的結(jié)合,且一些已知的能與細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素結(jié)合的試劑和能降解硫酸乙酰肝素的酶類(lèi)能大大降低VLPs與細(xì)胞的結(jié)合,進(jìn)一步用馬來(lái)酸氯苯那敏片處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)硫酸乙酰肝素的硫酸化修飾對(duì)其與VLPs結(jié)合起關(guān)鍵作用[15]。

2 細(xì)胞蛋白受體

除了能以唾液酸作為細(xì)胞受體之外,近年來(lái)幾個(gè)工作組又鑒定出了FCV其他的功能性受體并對(duì)其進(jìn)行了深入的研究,Makino A等[16]從CRFK細(xì)胞的cDNA文庫(kù)中調(diào)出了能與FCV F4毒株結(jié)合的細(xì)胞黏附蛋白JAM-A,抗JAM-A抗體能夠阻斷FCV感染CRFK細(xì)胞,同時(shí)貓JAM-A(feline JAMA,fJAM-A)分子在FCV非敏感倉(cāng)鼠肺細(xì)胞中的表達(dá)能使FCV F4毒株及其他幾株測(cè)試株感染該細(xì)胞,說(shuō)明fJAM-A是FCV的一種功能性受體分子。對(duì)fJAM-A分子的不同區(qū)域與FCV的結(jié)合能力進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),僅Ig樣的細(xì)胞外區(qū)域D1在與FCV結(jié)合過(guò)程中是必需的,其他的區(qū)域皆能被替代,但用FCV進(jìn)行細(xì)胞感染時(shí),除D1區(qū)域外,fJAM-A分子的其他區(qū)域也是病毒感染必不可少的。同時(shí),fJAM-A表達(dá)于細(xì)胞表面并不滿(mǎn)足所有該研究所用FCV分離株對(duì)細(xì)胞的易感性,由此,作者推測(cè)fJAM-A蛋白是FCV的輔助受體,除fJAM-A之外,還需要其他因子參與FCV的感染,同時(shí)對(duì)于不同的分離株,需要不同的因子參與[17]。Bhella D等[18]對(duì)FCV衣殼蛋白VP1與fJAM-A分子結(jié)合的部位進(jìn)行了探討,發(fā)現(xiàn)VP1的P2結(jié)構(gòu)域的外表面(含有高可變區(qū)及中和抗原表位)參與VP1與fJAM-A的結(jié)合,之后,VP1蛋白構(gòu)象發(fā)生改變,啟動(dòng)病毒脫衣殼。由此可見(jiàn),對(duì)于FCV的細(xì)胞受體主要集中于兩點(diǎn),一是細(xì)胞表面的碳水化合物,二是細(xì)胞表面蛋白,FCV侵入宿主細(xì)胞是一個(gè)多方位的過(guò)程,需要多種因素參與。關(guān)于NoV細(xì)胞蛋白受體的研究,也有零星的報(bào)道。T amura M等[19]通過(guò)病毒輔覆蛋白印跡技術(shù)(virus overlay protein blot assay,VOPBA)發(fā)現(xiàn)一個(gè)存在于多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系細(xì)胞膜上的分子質(zhì)量為105 ku的膜蛋白能與諾瓦克病毒樣顆粒直接相互作用,這種結(jié)合不依賴(lài)膜蛋白的天然構(gòu)象,推測(cè)該蛋白是病毒的細(xì)胞受體,但該蛋白為何種物質(zhì)尚未得到鑒定。2003年又報(bào)道可溶性的組蛋白分子能夠阻斷諾瓦克病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞,H1組蛋白不僅能與諾瓦克病毒粒子結(jié)合,而且能結(jié)合于宿主細(xì)胞[20],該研究結(jié)果不僅給病毒受體研究提供了借鑒,而且為抗病毒藥物的研發(fā)提供了思路。

3 結(jié)語(yǔ)

病毒受體的研究一直是病毒學(xué)科的熱點(diǎn)和難點(diǎn),而研究方法的選用恰當(dāng)與否決定了病毒受體的研究進(jìn)程。除了一些通用的方法如文庫(kù)篩選、噬菌體表面展示技術(shù)、VOPBA、免疫共沉淀技術(shù)、克隆表達(dá)技術(shù)及病毒受體阻斷劑的應(yīng)用等等,針對(duì)杯狀病毒科病毒的特點(diǎn)還可選用如下幾種替代方法:①由于該科病毒大部分缺乏體外培養(yǎng)體系,因此可以采用假病毒體系來(lái)替代野生病毒進(jìn)行受體研究;②杯狀病毒衣殼蛋白能自聚合形成VLPs,也可通過(guò)表達(dá)獲得自聚合形成VLPs的衣殼蛋白來(lái)代替野生病毒進(jìn)行受體研究;③病毒受體大多為膜蛋白,常規(guī)的酵母雙雜交發(fā)生于細(xì)胞核中,不適合病毒受體的篩選,可以用Split-ubiquitin膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)替代[21-24]。

病毒感染宿主的基本前提是它首先要與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合,這種結(jié)合不僅決定病毒的致病性,也決定病毒的宿主嗜性范圍。杯狀病毒細(xì)胞受體的闡明將有助于揭示病毒的感染途徑及其致病的分子機(jī)制,對(duì)于深刻理解病毒與宿主細(xì)胞的相互關(guān)系以及有針對(duì)性地研制有效的抗病毒藥物、疫苗具有重大的理論與實(shí)踐意義。更進(jìn)一步,如果能找到病毒黏附蛋白與病毒受體的結(jié)合位點(diǎn),就可以從封閉病毒的受體結(jié)合位點(diǎn)和封閉受體兩方面來(lái)阻斷病毒與受體的結(jié)合。

[1] 劉光清,陳鴻軍,陳 柳,等.動(dòng)物病毒反向遺傳學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2009:128-140.

[2] Ruvon-Clouet N,Ganire J P,Andr-Fontaine G,et al.Binding of rabbit haemorrhagic disease virus to antigens of the ABH blood group family[J].J Virol,2000,74(24):11950-11954.

[3] Rademacher C,Krishna N R,Palcic M,et al.NM R experiments reveal the molecular basis of receptor recognition by a calicivirus[J].J Am Chem Soc,2008,130(11):3669-3675.

[4] 曾 玫,王曉紅,朱啟镕.諾如病毒及其受體人類(lèi)組織血型抗原的研究進(jìn)展[J].臨床兒科雜志,2007,25(12):1036-1039.

[5] Marionneau S,Ruvoen N,Le Moullac-Vaidye B,et al.Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals[J].Gastroenterology,2002,122(7):1967-1977.

[6] Huang P,Farkas T,Marionneau S,et al.Noroviruses bind to human ABO,Lewis,and secretor histo-blood group antigens:identification of 4 distinct strain-specific patterns[J].J Infect Dis,2003,188(1):19-31.

[7] Tan M,Huang P,Meller J,et al.Mutations within the P2 domain of norovirus capsid affect binding to human histo-blood group antigens:evidence for a binding pocket[J].J Virol,2003,77(23):12562-12571.

[8] Tan M,Hegde R S,Jiang X.The P domain of norovirus capsid protein forms dimer and binds to histo-blood group antigen receptors[J].J Virol,2004,78(12):6233-6242.

[9] Tan M,Jiang X.The p domain of norovirus capsid protein forms a subviral particle that binds to histo-blood group antigen receptors[J].J Virol,2005,79(22):14017-14030.

[10] K reutz L C,Seal B S.The pathway of feline calicivirus entry[J].Virus Res,1995,35:63-70.

[11] Stuart A D,Brown T D K.Entry of feline calicivirus is dependent on clathrin-mediated endocytosis and acidification in endosomes[J].J Virol,2006,80(15):7500-7509.

[12] K reutz L C,Seal B S,Mengeling W L.Early interaction of feline calicivirus with cells in culture[J].Arch Virol,1994,136(1-2):19-34.

[13] Stuart A D,Brown T D.α 2,6-linked sialic acid acts as a receptor for feline calicivirus[J].J Gen Virol,2007,88:177-186.

[14] Taube S,Perry J W,Yetming K,et al.Ganglioside-linked terminal sialic acid moieties on murine macrophages function as attachment receptors for murine noroviruses[J].J Virol,2009,83(9):4092-4101.

[15] Tamura M,Natori K,Kobayashi M,et al.GenogroupⅡnoroviruses efficiently bind to heparan sulfate proteoglycan associated with the cellular membrane[J].J Virol,2004,78(8):3817-3826.

[16] M akino A,Shimojima M,Miyazawa T,et al.Junctional adhesion molecule 1 is a functional receptor for feline calicivirus[J].J Virol,2006,80:4482-4490.

[17] Ossiboff R J,Parker J S L.Identification of regions and residues in feline junctional adhesion molecule required for feline calicivirus binding and infection[J].J Virol,2007,81(24):13608-13621.

[18] Bhella D,Gatherer D,Chaudhry Y,et al.Structural insights into calicivirus attachment and uncoating[J].J Virol,2008,82(16):8051-8058.

[19] Tamura M,NatorI K,Kobayashi M,et al.Interaction of recombinant norwalk virus particles with the 105-kilodalton cellular binding protein,a candidate receptor molecule for virus attachment[J].J Virol,2000,74(24):11589-11597.

[20] Tamura M,Natori K,Kobayashi M,et al.Inhibition of attachment of virions of Norwalk virus to mammalian cells by soluble histone molecules[J].A rch Virol,2003,148(9):1659-1670.

[21] T haminy S,Miller J,Stagljar I.The split-ubiquitin membrane-based y east two-hybrid system[J].Methods Mol Biol,2004,261:297-312.

[22] 曹 煒.Split-ubiquitin膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)的構(gòu)建及其應(yīng)用[D].上海:復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,2007:1-95.

[23] Dirnberger D,Messerschmid M and Baumeister R.An optimized split-ubiquitin cDNA-library screening system to identify novel interactors of the human Frizzled1 receptor[J].Nucleic Acids Res,2008,36(6):e37.

[24] Kittanakom S,Chuk M,Wong V,et al.Analysis of membrane protein complexes using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid(MYTH)system[J].Methods Mol Biol,2009,548:247-271.