張靜，彭海，陳禪友

（江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢，430056）

豇豆（Vigna unguiculataL.Walp.）是一種重要的豆科植物，全球種植面積超過12 500萬hm2，年產(chǎn)量超過300萬t[1]。豇豆起源于非洲，傳入亞洲后，在中國與印度分別形成了長豇豆（V.sesquipedalis）與短豇豆（V.cylindrica）2個栽培亞種，另外有1個亞種為普通豇豆（V.unguiculata），故栽培豇豆共有3個亞種。其中，長豇豆是豇豆中經(jīng)濟性上很重要的一個亞種，可菜用，還可作動物飼料[2]，因而被廣泛種植于東南亞與中國各地。中國是長豇豆的次生起源中心[3]，具有悠久的栽培歷史。中國地域遼闊、生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，長豇豆在全國各地都有種植，因此形成了豐富的長豇豆地方品種。加之近年來長豇豆育種工作日見成效，進一步豐富了中國長豇豆遺傳資源庫，需要對這些資源進行遺傳關(guān)系分析，為品種資源保存、利用、育種以及解決品種爭議打下基礎(chǔ)。結(jié)合我們的研究成果，本文介紹了分子標(biāo)記在長豇豆遺傳資源鑒定中的應(yīng)用情況，并針對存在的問題，提出了幾點看法。

1 用于長豇豆遺傳分析的分子標(biāo)記類型及其體系的建立

一般來說，蛋白質(zhì)分子標(biāo)記如各種同工酶的提取與電泳檢測在各種植物中程序變化不大，因此，一般不需要建立和優(yōu)化反應(yīng)體系。由于不同植物基因組堿基組成不同，而以PCR為基礎(chǔ)的眾多分子標(biāo)記都需要引物與基因組配對才能擴增，因此反應(yīng)條件存在差異。需要針對不同植物種類和分子標(biāo)記類型對反應(yīng)條件進行優(yōu)化才能獲得最佳的擴增效果。

ISSR是由Zietkiewicz等[4]提出的用于擴增兩個距離較近的相鄰SSR位點間序列的一種方法。其原理是同一ISSR引物序列同時與兩個距離較近但方向相反的SSR重復(fù)序列互補結(jié)合[5]，在模板、Taq酶和dNTP等存在的情況下擴增這兩個SSR位點間的序列，因此ISSR變異來源于SSR位點多態(tài)性本身與SSR位點間的序列變異。在牛筋草和高粱的遺傳分析中，ISSR技術(shù)被認(rèn)為比RFLP更便宜，比RAPD重復(fù)性更高[5～6]。ISSR技術(shù)被認(rèn)為更適合于遺傳多樣性較低的栽培品種內(nèi)的遺傳分析[7～8]，而通過RAPD等分子標(biāo)記檢測，豇豆種內(nèi)多態(tài)性較低，作為豇豆的一種亞種，長豇豆內(nèi)多態(tài)性應(yīng)更低，因此，推測高多態(tài)性的ISSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)適合長豇豆亞種DNA多態(tài)性分析。彭海等[9]對長豇豆ISSR反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的濃度進行了初步篩選，通過正交設(shè)計試驗確定了這4種關(guān)鍵成分的最終濃度，即引物為0.2 μM、模板為0.75 ng/μL、dNTP各200 μM/L和Taq聚合酶為0.5 U時，ISSR擴增效果最好。由于不同ISSR引物組成差異較大，除各種PCR反應(yīng)成分要影響ISSR擴增帶型外，引物退火溫度也可顯著影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。為此，彭海等[10]通過試驗測定獲得了長豇豆品種25條ISSR引物的最佳退火溫度，發(fā)現(xiàn)不同引物間的差異較大，變異系數(shù)達到8.80%。與理論推測的退火溫度比較發(fā)現(xiàn)，實測值與理論值間不具有明顯的相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)僅為0.37。因此認(rèn)為，可能試驗實測是獲得最佳退火溫度的唯一途徑。在長豇豆ISSR-PCR分析過程中，彭海等[11]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)模板濃度為0時（空白對照），ISSR反應(yīng)同樣可以擴增出條帶。因此ISSR引物可以在所有生物中通用，由于空氣中不可避免地存在微生物，因此，我們認(rèn)為，污染應(yīng)來源于空氣中的微生物等。由于科學(xué)研究最基本的要求是現(xiàn)象能夠重現(xiàn)，而污染問題已經(jīng)嚴(yán)重影響到了這一原則。因此建議，在長豇豆ISSR與RAPD反應(yīng)中都應(yīng)該注意微生物污染的問題，整個反應(yīng)體系所涉及的藥品與器材應(yīng)消毒，且整個操作應(yīng)在超凈工作臺上嚴(yán)格進行，同時應(yīng)在反應(yīng)中設(shè)立陰性對照，陽性也應(yīng)設(shè)重復(fù)，以監(jiān)控污染是否產(chǎn)生。

微衛(wèi)星或簡單重復(fù)序列（SSR）是指1~6個核苷酸所組成的串聯(lián)重復(fù)序列，SSR標(biāo)記是一種以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)[12～13]。因其變異頻率高，其在遺傳作圖以及分析種間、亞種間、品種間甚至是品種內(nèi)親緣關(guān)系等方面都是一種理想的工具[14~16]。在禾本科植物如水稻[17]，以及豆類植物如大豆[18]、四季豆[19]中都已經(jīng)開發(fā)出較多的SSR引物。但在豇豆中開發(fā)的微衛(wèi)星引物較少，僅Li等[20]開發(fā)了65對微衛(wèi)星引物，并證明其中27對引物能擴增出多態(tài)性帶。之后這27對微衛(wèi)星引物被多次應(yīng)用于豇豆遺傳多樣性的研究中[21～22]。彭海等[23]對長豇豆SSR反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的濃度進行了正交設(shè)計分析，結(jié)果表明引物濃度對長豇豆SSR擴增影響明顯，其他3種成分濃度沒有顯著影響，基因組差異亦對反應(yīng)沒有明顯影響。通過進一步引物濃度試驗并結(jié)合成本考慮，確定長豇豆SSR反應(yīng)中成分的最佳濃度為：模板 1 ng/μL、引物 1.6 μmol/L、dNTP 100 μM/L、Taq聚合酶0.5 U。利用優(yōu)化后的程序，彭海等[24]進一步對這27對已報道的SSR引物針對長豇豆進行了篩選，但僅有13對引物能對長豇豆基因組進行有效擴增。用這13對SSR引物對67份長豇豆品種進行分析表明：僅5對具有多態(tài)性（資料待發(fā)表）。以上資料表明，需要進一步針對長豇豆開發(fā)SSR引物數(shù)量，才能利用其分析長豇豆亞種遺傳關(guān)系。

Vos等[25]于1995年公布了AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)的大致原理與流程如下：利用兩個限制性內(nèi)切酶切割基因組，分別利用與酶切位點配對的接頭與酶切片斷連接，再利用與接頭配對的引物進行預(yù)擴和選擇性擴增。AFLP分子標(biāo)記有兩大特點。第一，與ISSR分子標(biāo)記類似，可用于任何物種；第二，每一對引物組合擴增的位點數(shù)一般可達到50~100，擴增效率極高。因此，在其他分子標(biāo)記都無法找到多態(tài)性時，一般AFLP可有效地獲得多態(tài)性標(biāo)記。豇豆栽培種中其他分子標(biāo)記如RAPD所揭示的多態(tài)性不到20%[22，26]，遠不及其他作物[27～28]，因此，AFLP分子標(biāo)記在對長豇豆亞種遺傳多樣性分析中具有其特殊作用。然而，AFLP分析涉及酶切、連接、預(yù)擴、選擴和電泳等復(fù)雜程序，因此，容易產(chǎn)生假陽性，為了準(zhǔn)確獲得研究結(jié)果，有必要對AFLP反應(yīng)程序進行優(yōu)化。劉永華等[29]利用抗病與感病長豇豆為材料，建立并優(yōu)化了長豇豆AFLP反應(yīng)程序。除AFLP標(biāo)準(zhǔn)程序外，他認(rèn)為高質(zhì)量的基因組DNA是AFLP試驗成功的關(guān)鍵因素。我們也認(rèn)為，基因組DNA質(zhì)量好壞，影響酶切是否徹底，能決定最終結(jié)果中假陽性的比率。我們試驗了SDS，CTAB和試劑盒提取的長豇豆基因組DNA對酶切效果的影響，發(fā)現(xiàn)都存在酶切不完全的現(xiàn)象（資料未發(fā)表）。特別值得一提的是：雖然利用植物基因組試劑盒提取的DNA從分光光度計和電泳檢測結(jié)果來看，質(zhì)量都很好，但酶切效果依然較差。通過在標(biāo)準(zhǔn)提取程序中添加PVP和1%β-巰基乙醇，并且采用超純水而不是TE溶解DNA，可以很大程度上解決酶切不充分的問題。由此可見，基因組DNA提取雖然已是經(jīng)典的實驗操作，但應(yīng)用于高敏感性的AFLP反應(yīng)程序中，依然存在較多需討論之處。

2 分子標(biāo)記在長豇豆遺傳分析中的應(yīng)用

直接以長豇豆為材料的研究不太多。胡志輝等[30]利用過氧化氫酶（CAT）和淀粉酶（AMY）的同功酶酶譜分析了21個長豇豆品種的多樣性，獲得的3個多樣性位點可區(qū)分所供試的長豇豆品種。然而，Reis等[31]利用等位酶標(biāo)記分析了豇豆遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)整個豇豆屬內(nèi)多態(tài)性都不高，且利用等位酶無法將長豇豆亞種與其他豇豆亞種區(qū)分開來。同樣，Panella等[32]雖然認(rèn)為等位酶可以很好地對豇豆種進行劃分，但不能在栽培種之間進行區(qū)分。說明等位酶標(biāo)記在豇豆特別是長豇豆遺傳多樣性分析中存在一定局限性。利用細胞保護酶標(biāo)記和形態(tài)學(xué)標(biāo)記，Chen等[33]進一步分析了23個長豇豆品種對鹽脅迫的響應(yīng)，利用系統(tǒng)聚類，將這23個品種分為耐鹽和不耐鹽兩個明顯類群，顯示了細胞保護酶標(biāo)記等在耐鹽長豇豆資源鑒定中的作用。利用Li等[20]開發(fā)的SSR引物，Phansak等[34]對全球范圍內(nèi)15個長豇豆品種在16個SSR標(biāo)記位點上的多態(tài)性進行了分析，發(fā)現(xiàn)在相似系數(shù)為0.67處，可將這些長豇豆分為3個類群，然而，它們似乎與長豇豆的地理起源并無關(guān)系。該研究中，中國起源的長豇豆品種僅3個，由于品種數(shù)少，在全基因組范圍內(nèi)檢測的位點數(shù)也僅有16個，可能造成結(jié)果可靠性變差，且對長豇豆品種，特別是中國長豇豆品種的代表性較差。Sarutayophat等[35]利用5個RAPD引物分析了37份長豇豆品種遺傳關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這些RAPD引物能相對較好地將長豇豆和豇豆分成不同的類群。最近，陳禪友等[36]利用23個有效RAPD分子標(biāo)記分析了40個長豇豆品種遺傳多樣性，根據(jù)長豇豆品種DNA分子RAPD系統(tǒng)樹圖，可將長豇豆品種分為5個品種群，從而彌補根據(jù)形態(tài)性狀異同來判別品種的不足，研究揭示了由于自然和人工選擇可遺傳性狀變異積累、地理隔離歧化和人工雜交強化基因重組等共同作用而形成的品種基因組差異的現(xiàn)實。

其他研究部分涉及長豇豆亞種。Chen等[37]利用種子貯藏蛋白分析了中國栽培豇豆屬及近緣屬遺傳變異，分析涉及早翠等7個長豇豆品種代表。研究發(fā)現(xiàn)：長豇豆亞種內(nèi)品種間差異很小，所用的7個品種僅顯示出3種帶型，且彼此相似。相反，大豆品種間和飯豆品種間呈現(xiàn)出遺傳多態(tài)性。兩個豌豆品種表現(xiàn)出種內(nèi)相似的種子蛋白質(zhì)帶型，但能夠彼此區(qū)分。該研究與前人利用RAPD等[22，26]分子標(biāo)記對長豇豆遺傳多樣性分析的結(jié)果相類似，即多態(tài)性都不高。與Chen等[37]研究相對應(yīng)，F(xiàn)ana Sylla等[38]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)研究了豇豆栽培種、野生種及其近緣種間的親緣關(guān)系。但長豇豆亞種內(nèi)僅2個品種，分別來自蘇格蘭和菲律賓。在擴增獲得的202個RAPD條帶中，發(fā)現(xiàn)了3個條帶僅長豇豆亞種中含有，顯示了它們在區(qū)分長豇豆亞種與其他豇豆亞種中的潛在作用。另一項類似研究的材料涉及意大利的豇豆地方品種和一個長豇豆選育品種[39]。雖然長豇豆材料所占比重很小，但74.6%的RAPD多態(tài)性帶型都由長豇豆所特有，其中24個RAPD引物可將意大利育成的長豇豆品種與其他豇豆地方品種區(qū)分開[39]，顯示了長豇豆與其他豇豆品種在分子標(biāo)記上存在巨大差異，或者，這些RAPD引物可能與育種者所關(guān)心的一些關(guān)鍵性狀如產(chǎn)量、抗性等緊密連鎖。

除RAPD外，其他分子標(biāo)記也被廣泛用于長豇豆資源分析中。Archana等[40]利用SSR分子標(biāo)記分析了豇豆屬遺傳多樣性，其中包含一個來源于中國的長豇豆品種。結(jié)果表明：長豇豆亞種在聚類圖上比豇豆的另一原始栽培亞種textilis更接近普通豇豆亞種。Fatokun等[41]在利用RFLP標(biāo)記分析豇豆親緣關(guān)系時也得到了類似結(jié)論：長豇豆亞種在聚類圖上與其他栽培種和野生亞種dekindtiana關(guān)系密切。這些結(jié)論都與長豇豆的起源與傳播過程相一致。但另一些研究結(jié)論與此存在一定差異。Gillaspie等[42]利用AFLP和SSR分子標(biāo)記分析了豇豆不同亞種間的遺傳關(guān)系，其中涉及3個長豇豆品種。雖然AFLP和SSR標(biāo)記的多態(tài)性都較高，但聚類結(jié)果卻顯示豇豆野生亞種dekindtiana被混入了長豇豆栽培亞種之中。此現(xiàn)象與形態(tài)學(xué)觀察相差甚遠，因為長豇豆屬于栽培種，與野生亞種dekindtiana差別相當(dāng)明顯，如種子更大等。同樣，26個有效的DAF標(biāo)記并不能將長豇豆亞種與短豇豆亞種區(qū)分開來[43]。以上結(jié)果提示我們：在豇豆或長豇豆亞種內(nèi)遺傳多樣性分析中，應(yīng)結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果，仔細分析分子標(biāo)記的結(jié)果，否則容易出現(xiàn)明顯的偏頗。值得一提的是，Tosti等[39]比較了RAPD、AFLP和SAMPL標(biāo)記在分析豇豆地方品種（含長豇豆）親緣關(guān)系中的利用價值，發(fā)現(xiàn)SAMPL標(biāo)記所需要的引物數(shù)最少，且與表型相關(guān)性最為顯著，顯示SAMPL標(biāo)記在豇豆親緣關(guān)系分析中具有獨特優(yōu)勢。

3 問題與展望

3.1 針對長豇豆的SSR分子標(biāo)記過少

雖然各種分子標(biāo)記都可應(yīng)用于長豇豆遺傳關(guān)系分析，然而各種分子標(biāo)記在豇豆資源鑒定中各有其自身優(yōu)勢與不足。RAPD標(biāo)記檢測的位點多，引物通用，但普遍認(rèn)為不夠穩(wěn)定，而且在豇豆中RAPD標(biāo)記不能反應(yīng)親緣關(guān)系，被認(rèn)為不適合做豇豆親緣關(guān)系分析[22]。AFLP與SAMPL標(biāo)記的多態(tài)性很高，能夠有效區(qū)分普通豇豆不同品種[26]，然而酶切、擴增與PAGE檢測程序復(fù)雜，費用高，在基礎(chǔ)研究中應(yīng)用較多而在品種純度或資源鑒定等研究中應(yīng)用較少。ISSR標(biāo)記雖然不需要復(fù)雜的檢測程序且具有較高的多態(tài)性，然而與AFLP、RAPD一樣，屬于非共顯性標(biāo)記，此特點決定其很難用于檢測雜合基因型。SSR標(biāo)記引物序列特異，多態(tài)性高且為共顯性，在資源與種子純度鑒定等方面應(yīng)用最為廣泛，然而目前在整個豇豆屬中有差異的有效SSR標(biāo)記僅20多個[20]，由于長豇豆亞種內(nèi)品種間親緣關(guān)系更近，因而有效SSR標(biāo)記更少，根據(jù)我們研究結(jié)果，僅有13對SSR引物能對長豇豆基因組進行有效擴增[24]，其中僅5對具有多態(tài)性（資料待發(fā)表），還遠不能滿足實際應(yīng)用的需要，需要開發(fā)更多的長豇豆SSR引物。

3.2 長豇豆分子標(biāo)記多態(tài)性偏低與形態(tài)性狀多態(tài)性高的矛盾

雖然多項分子標(biāo)記如等位酶[31]和DNA標(biāo)記[22,26]的研究結(jié)果都揭示豇豆或長豇豆亞種內(nèi)遺傳多樣性較低，然而它們在莢色、莢長和莢質(zhì)量等形態(tài)學(xué)性狀上存在較大的差異[35,44]，這種現(xiàn)象一方面提示我們在運用分子標(biāo)記研究長豇豆遺傳多樣性時，應(yīng)結(jié)合形態(tài)學(xué)的結(jié)果進行解釋，另一方面也促使我們?nèi)ニ伎迹簽槭裁捶肿訕?biāo)記所揭示的遺傳多樣性并沒有在表型中表現(xiàn)出來？是因為我們大量檢測的變異位點屬于中性變異，與自然選擇或性狀表現(xiàn)無關(guān)嗎？從最近的一項研究來看，這種推測是具有一定依據(jù)的。Li Wang等[45]利用基因起源的分子標(biāo)記研究了美國農(nóng)業(yè)部收集的豇豆資源親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)承受了較小自然選擇壓力的內(nèi)含子比外顯子更能揭示遺傳多樣性。最近，我們研究了長豇豆亞種內(nèi)不同品種間DNA甲基化修飾多態(tài)性差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同品種間除在DNA序列上存在明顯不同外，在甲基化修飾上也存在明顯的差異（結(jié)果待發(fā)表）。雖然DNA甲基化不能通過傳統(tǒng)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)檢測到，但DNA甲基化卻廣泛參與了植物生長發(fā)育和性狀的表現(xiàn)，因此，以DNA甲基化修飾為代表的表觀遺傳學(xué)可能是遺傳標(biāo)記與形態(tài)學(xué)差異的原因之一。

3.3 需要將分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合

雖然包括陳禪友等[46]在內(nèi)的眾多研究都在形態(tài)學(xué)水平上分析了長豇豆亞種遺傳多樣性，同時，各種分子標(biāo)記也被多次應(yīng)用于長豇豆遺傳資源鑒定，然而，這二者相結(jié)合的研究卻相對較少。只有當(dāng)分子標(biāo)記所提示的DNA多態(tài)性信息與生物學(xué)功能相結(jié)合才能指導(dǎo)種質(zhì)資源保存與育種實踐，因此，長豇豆分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合應(yīng)在以后研究中得到加強。

[1]Singh B B,Chambliss O L,Sharma B,Recent advances in cowpea breeding[M]//Singh B B,MohanRaj D R,Dashiell K E,et al.Advances in cowpea research.Ibadan,1997:IITA-JIRCAS30-49.

[2]Wests D W,Francois L E.Effects of salinity on germination,growth and yield of cowpea[J].Irrig Sci,1983(3):169-175.

[3]Singh S R,Rachie K O.Cowpea research,production and utilization,in Genetic diversity in Vigna,J.P.Baudoin and R.Maréchal Editors[M].John Wiley&Sons Press:Chichester,1985.

[4]Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20(2):176-183.

[5]Yang W,De Oliveira A C,Godwin I,et al.Comparison of DNA marker technologies in characterizing plant genome diversity:Variability in Chinese sorghums[J].Crop Science Society of America,1996,36(6):1 669-1 676.

[6]Salimath S S,De Oliveira A C,Godwin I D,et al.Assessment of genome origins and genetic diversity in the genus Eleusine with DNA markers[J].Genome,1995,38(4):757-763.

[7]Gonzalez A,Wong A,Delgado-Salinas A,et al.Assessment of Inter Simple Sequence Repeat Markers to Differentiate Sympatric Wild and Domesticated Populations of Common[J].Bean Crop Sci 2005,45(2):606-615.

[8]Ajibade S R,Weeden N F,Chite S M.Inter simple sequence repeat analysis of genetic relationships in the genus Vigna[J].Euphytica,2000,V111(1):47-55.

[9]彭海，張靜，張路帆，等.對長豇豆品種ISSR反應(yīng)體系中4種關(guān)鍵成分的優(yōu)化[J].北方園藝，2007（12）：186-188.

[10]彭海，張靜，張梁，等.長豇豆品種ISSR-PCR最佳退火溫度的篩選[J].長江蔬菜，2007（9）：49-51.

[11]彭海，張靜，王博，等.ISSR反應(yīng)中空氣污染及其預(yù)防[J].北方園藝，2007（9）：47-48.

[12]Powell W,Machray G C,Provan J.Polymorphism revealed by simple sequence repeats[J].Trends Plant Sci,1996,1(7):215-222.

[13]Morgante M,Olivieri A M.PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics[J].Plant J,1993,3(1):175-182.

[14]Lee M.DNA markers and plant breeding programs[J].Adv Agron,1995,55:265-344.

[15]Mitchell S E,Kresovich S,Jester C A,et al.Application of multiplex PCR and fluorescence-based,semi-automated allele sizing technology for genotyping plant genetic resources[J].Crop Sci,1997,37(2):617-624.

[16]Matus I A,Hayes P M.Genetic diversity in three groups of barley germplasm assessed by simple sequence repeats[J].Genome,2002,45(6):1 095-1 106.

[17]Temnykh S,Park W D,Ayres N,et al.Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice(Oryza sativaL.)[J].Theor Appl Genet,2000,100(5):697-712.

[18]Cregan P B,Jarvik T,Bush A L,et al.An integrated genetic linkage map of the soybean genome[J].Crop Sci Soc America,1999:1 464-1 490.

[19]Blair M W,Giraldo M C,Buendía H,et al.Microsatellite marker diversity in common bean (Phaseolus vulgarisL.)[J].Theor Appl Genet,2006,113(1):100-109.

[20]Li C D,Fatokun C A,Ubi B,et al.Determining genetic similarities and relationships among cowpea breeding lines and cultivars by microsatellite markers[J].Crop Science Society of America,2001,41(1):189-197.

[21]Gillaspie A G,Hopkins M S,Dean R E.Determining genetic diversity between lines of Vigna unguiculata subspecies by AFLP and SSR markers[J].Genetic Resources and Crop Evolution,2005,52(3):245-247.

[22]Diaga D,Khidir W H.Microsatellites and RAPD Markers to Study Genetic Relationships Among Cowpea Breeding Lines and Local Varieties in Senegal[J].Genetic Resources and Crop Evolution,2005,52(8):1057-1067.

[23]彭海，張靜，徐凡，等.長豇豆（V.sesquipedalis）SSR 反應(yīng)體系的建立[J].種子，2007，26（10）：39-41.

[24]彭海，張靜，徐凡，等.長豇豆 SSR有效引物的篩選與反應(yīng)程序的確定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，46（4）：504-507.

[25]Vos P,Hogers R,Bleeker M,et al.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Res,1995,23(21):4 407-4 414.

[26]Tosti N,Negri V.Efficiency of three PCR-based markers in assessing genetic variation among cowpea (Vigna unguiculatasubsp.unguiculata)landraces[J].Genome,2002,45(2):268-275.

[27]Pasquet R S.Variation at isoenzyme loci in wildVigna unguiculata(L.)Walp.(Fabaceae,Phaseoleae)[J].Plant Syst Evol,1993,186:157-173.

[28]Pasquet R S.Allozyme diversity of cultivated cowpeaVigna unguiculata (L.)Walp[J].TAG Theoretical and Applied Genetics,2000,101(1):211-219.

[29]劉永華，李國景，吳曉花，等.長豇豆 AFLP技術(shù)體系的構(gòu)建與優(yōu)化[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，19（3）：156-159.

[30]胡志輝，陳禪友.長豇豆品種同功酶的遺傳多樣性分析[J].北方園藝，2002（4）：46-47.

[31]Reis C M,Frederico A M.Genetic diversity in cowpea(Vigna unguiculata)using isozyme electrophoresis.in ISHS Acta Horticulturae 546:InternationalSymposium on Molecular Markers for Characterizing Genotypes and I-dentifying Cultivars in Horticulture,2000:ISHS.

[32]Panella L,Gepts P.Genetic relationships withinVigna unguiculata(L.)Walp.based on isozyme analyses[J].Genetic Resources and Crop Evolution,1992,39(2):71-88.

[33]Chen C Y,Tao C,Peng H,et al.Genetic analysis of salt stress responses in Asparagus bean(Vigna unguiculata(L.)ssp.sesquipedalis Verdc.)[J].J Hered,2007,98(7):655-665.[34]Phansak P,Taylor P W J,Mongkolporn O.Genetic diversity in yardlong bean(Vigna unguiculatassp.sesquipedalis)and related Vigna species using sequence tagged microsatellite site analysis[J].Scientia Horticulturae,2005,106(2):137-146.

[35]Sarutayophat T,Nualsri C,Santipracha Q,et al.Characterization and genetic relatedness among 37 yardlong bean and cowpea accessions based on morphological characters and RAPD analysis[J].Songklanakarin Journal of Science and Technology,2007,29:591-600.

[36]陳禪友，潘磊，胡志輝，等.長豇豆品種資源的 RAPD分析[J].江漢大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，36（4）：77-83.

[37]Chen C Y,Pan L,Hu Y J,et al.Analysis of genetic variation of seed protein in the genus Vigna and among its relatives cultivated in China[J].Wuhan University Journal of Natural Sciences,2006,11(3):725-773.

[38]Fana Sylla B,Remy S P,Paul G.Genetic diversity in cowpea[Vigna unguiculata (L.)Walp.]as revealed by RAPD markers[J].Genet Res Crop Evol,2004,51:539-550.

[39]Tosti N,Negri V.Efficiency of three PCR-based markers in assessing genetic variation among cowpea (Vigna unguiculatasubsp.unguiculata)landraces[J].Genome Biol,2002,45:268-275.

[40]Archana V,Jawali N.Genetic variation and relatedness in Vigna unguiculata revealed by microsatellites[J].Barc Newsletter,2007,285:190.

[41]Fatokun C A,Danesh D,Young N D,et al.Molecular taxonomic relationships in the genus Vigna based on RFLP analysis[J].TAG Theoretical and Applied Genetics,1993,86(1):97-104.

[42]Gillaspie A G,Hopkins M S,Dean R E.Determining genetic diversity between lines ofVigna unguiculatasubspecies by AFLP and SSR markers[J].Genet Resour Crop Ev,2005,52(3):245-247.

[43]Simon M V,Benko-Iseppon A M,Resende L V,et al.Genetic diversity and phylogenetic relationships inVigna savigermplasm revealed by DNA amplification fingerprinting[J].Genome,2007,50(6):538-547.

[44]李耀華，陳禪友，于衍正，等.豇豆品種資源的聚類分析[J].武漢植物學(xué)研究，1997，15（3）：255-261.

[45]Li W M,Barkley N A,Gillaspie G A,et al.Phylogenetic relationships and genetic diversity of the USDA Vigna germplasm collection revealed by gene-derived markers and sequencing[J].Genetics Research,2009,90(6):467-480.

[46]陳禪友，張鳳銀，胡志輝，等.長豇豆莢色、籽粒色及生長習(xí)性的遺傳研究[J].武漢植物學(xué)研究，2002，20（1）：5-7.