馬寧,蔡繼福,姜衛(wèi)劍首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院急診介入科,北京 100050

局灶性腦缺血動物模型的制備*

馬寧,蔡繼福,姜衛(wèi)劍#首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院急診介入科,北京 100050

局灶性腦缺血;動物模型;制備

#【通訊作者】姜衛(wèi)劍,Tel:86-10-67096611,E-m ail:cjr.jiangweijian@vip.163.com。

在中國,腦血管病的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢,給患者、家庭和社會造成巨大的負擔。臨床上腦血管病分為缺血性腦血管病和出血性腦血管病,其中以缺血性腦血管病多見。選擇合適的腦血管病動物模型,對于研究腦血管病發(fā)病機制、病理生理、診斷及防治等有重要意義。本文對局灶性腦缺血動物模型綜述如下。

1 局灶性腦缺血動物模型的要求

國際腦血管病委員會于1984年對局灶性腦缺血動物模型提出明確要求[1],對手術方式的要求為:盡量減小手術對腦的損害,避免顱內組織暴露于空氣,避免顱內環(huán)境穩(wěn)定性遭到破壞。對模型設計的要求為:單根血管可反復阻塞;該血管引起的改變可從血流改變等方面進行觀察;巴比妥類藥物在血管阻塞期間避免反復使用,以利于神經功能障礙的觀察;實驗對腦實質造成的病變應與人類病理改變相似;血流阻斷后可使血管再通,以恢復對缺血區(qū)的再灌注。

2 動物種類的選擇

2.1 大動物 以大動物(如猴、豬、狗、貓)為模型研究腦缺血的優(yōu)點:①雖然近年來某些影像學技術已可用于嚙齒類小動物[2,3],但大多數影像學技術,如核磁共振、功能影像檢測等更易用于大動物;②對大動物更易進行復雜的生理學監(jiān)測(如誘發(fā)電位監(jiān)測、腦電圖監(jiān)測、動脈血氣分析、血壓、血糖、乳酸和血紅蛋白測定),這些指標可在同一動物多點同時測量,并可與該動物的神經系統(tǒng)表現(xiàn)、神經生化、神經病理學表現(xiàn)等進行相互比較;③大動物更適合用于測量腦血流量和研究腦代謝;④大動物有腦回,使之在結構和功能上與人類更相似。以大動物為模型研究腦缺血的缺點:因監(jiān)測的方法通常為有創(chuàng)性,導致大動物缺血模型的死亡率較高;大動物費用高、飼養(yǎng)條件嚴格;不易判斷梗死是否完全,梗死灶變化較大;大動物需要不同的麻醉方式,可能對梗死灶產生影響。

2.2 小動物 以小動物為模型研究腦缺血的優(yōu)點:①小動物(特別是嚙齒類動物)購買、飼養(yǎng)的費用較大動物明顯降低;②小動物(特別是小鼠)在遺傳上同質,通過基因修飾可相對容易地得到多種不同特性的轉基因動物;③大、小鼠均有神經損傷程度的評價標準;④小動物腦體積小,可用某些特殊的固定技術對其進行固定[4]。以小動物為模型研究腦缺血的缺點:小動物缺乏腦回,在結構和功能上與人類有差異;難以進行生理學指標的監(jiān)測。

3 常用局灶性腦缺血動物模型

腦缺血模型分為全腦缺血與局灶性缺血,全腦缺血指全部或大部分腦的腦血流量降低,局灶性缺血指某個特定腦區(qū)的腦血流量降低。常用局灶性腦缺血模型制作方法有線栓法、開顱機械閉塞法、光化學誘導血栓形成法、血凝塊栓塞模型等。大多數局灶性腦缺血模型都是阻斷小動物[4-6]或大動物[7-9]某條主要腦血管,如大腦中動脈閉塞(m idd le cerebral artery occlusion,MCAO)模型。大腦中動脈阻斷,導致紋狀體和大腦皮質腦血流量持續(xù)減少,但血流減少的程度和分布與阻斷持續(xù)的時間、阻斷部位及大腦中動脈供血區(qū)側支血流的總量有關。目前廣泛應用的MCAO模型有數種,多是永久或臨時阻斷大腦中動脈的近端或遠端。

3.1 線栓法 線栓法自上世紀80年代后期即開始被廣泛應用于細胞損傷及神經保護機制的研究[10,11]。該方法通過向大鼠頸內動脈插入一段型號為4-0的尼龍縫線至大腦中動脈遠端,阻斷大腦中動脈;線栓的插入長度一般為從頸動脈分叉處起17～20 mm,以阻斷來自前交通動脈的側支循環(huán);將激光多普勒流速探頭置于預定梗死區(qū)域,可方便地觀察大腦中動脈阻斷后腦血流量的下降。Belayev等[12]將線栓以聚左旋賴氨酸包被,使其更緊密地黏附血管內皮細胞,得到大小更穩(wěn)定的梗死灶。通過這種技術,研究者觀察到大腦中動脈阻斷后,皮質、尾狀核及殼核的腦血流量減少80%,并維持于該水平[13]。抽出線栓可實現(xiàn)腦血流再灌注,術后動物可存活數天至數月,以便測量并記錄動物神經功能的變化[14]。線栓法在國內較常用。

3.2 開顱機械閉塞法 Tamura等[15]采用顳下顱骨切開術,并永久阻斷大鼠大腦中動脈近端血流的方法制作局灶性腦缺血模型,該模型導致大鼠大腦皮質、尾狀核及殼核梗死。

該方法可視性強,但損傷大,破壞顱腔完整性,并影響動物進食功能。Bederson等[16]對該方法進行改進,并證實大腦中動脈阻斷的具體位置和程度可影響動物的神經功能及神經病理學表現(xiàn)。通過永久阻斷大腦中動脈模型發(fā)現(xiàn),組織學異常的大腦皮質區(qū)域局部腦血流量約為25 m L/(100g?min),且缺血性損害的區(qū)域和腦血流量下降明顯的區(qū)域相吻合[17]。Duverger等[18]對比不同品系(W istar、SD、Fischer-344、SHRs及SHRSPs)大鼠永久性MCAO模型發(fā)現(xiàn),SHRs和SHRSPs大鼠的大腦半球梗死體積約為Wistar大鼠的1.5倍;SD大鼠的腦梗死體積也較大,但相對不穩(wěn)定;在血壓正常的品系中,Fischer-344大鼠的腦梗死體積最大且最穩(wěn)定。有學者用電凝大腦中動脈的方法制作腦缺血模型,這種模型腦血流量下降的程度和神經病理損傷的程度高度對應。

3.3 光化學法誘導血栓形成 有學者用光化學法制作MCAO模型,即給動物腹腔注射四氯四碘熒光素等光敏物質后,采用藍色氬染料激光透過顱骨照射大腦中動脈遠端分支,二者在血管內發(fā)生光化學反應,產生大量活性氧,損傷血管內皮細胞,引起血小板黏附、聚集,血栓形成,造成額頂葉皮質梗死,很少累及深層結構。該模型的缺點為光化學反應會造成微血管損傷。與Wistar大鼠相比,SD大鼠腦梗死灶較大且較一致。

3.4 血凝塊栓塞模型 此方法是通過頸外動脈逆行插管,將同種動物血凝塊直接注入頸總動脈。該模型造模過程相對簡單,最大缺點是梗死灶部位不一致。

4 其它局灶性腦缺血動物模型

4.1 再灌注模型 Shigeno等[19]使用圈套器節(jié)扎大腦中動脈或松解圈套器以達到阻斷血流及再灌注目的。此方法可用以研究細胞再灌注損傷,但對技術要求較高,常用于貓及靈長類動物的研究。

4.2 轉基因和基因敲除鼠 轉基因和基因敲除鼠為缺血和再灌注細胞損傷及神經保護機制中相關基因和蛋白質的研究提供新的方法[20-22]。線栓法也可應用于轉基因或基因敲除小鼠,并可通過控制術中的通氣、麻醉來控制多種生理學指標[23]。H attori等[24]報道MCAO術后小鼠的行為和認知改變。

4.3 大型動物模型 狒狒屬于大型動物,可用于同時測量多項生理參數。Symon等[8]在狒狒局灶性腦缺血模型完成后3年對其進行腦血流量測量,發(fā)現(xiàn)即使無明顯的病理學改變,許多梗死灶周圍組織的腦血流量仍較低,梗死灶周圍組織對二氧化碳的反應性及腦血流自動調節(jié)均受到損害。以狒狒為實驗動物的MCAO模型神經缺損癥狀與人類較相似,還可對狒狒進行神經系統(tǒng)檢查;狒狒在大腦中動脈阻斷的當時即出現(xiàn)面肌及上肢肌肉無力,數月后可能恢復。

5 MCAO局灶性腦缺血模型的評價

Bederson等[25]提出大鼠MCAO模型的4級3分評價法:0分,無神經功能缺損癥狀,未見神經病學征象;1分,輕度神經功能缺損,大鼠被提尾懸空時病灶對側前肢屈曲;2分,將大鼠放于軟塑料板上,握住鼠尾,側向推大鼠肩后,使鼠滑動數英寸,癱瘓側阻力明顯減低,但無轉圈運動;3分,重度神經功能缺損,除2分的癥狀外,還出現(xiàn)轉圈運動。Longa[26]改進 Bederson等的評分法,提出5級4分評分法:0分,無神經功能缺損癥狀;1分,不能伸展前爪,輕度神經功能缺損;2分,轉圈運動,中度神經功能缺損;3分,向病灶對側跌倒,重度神經功能缺損;4分,不能自發(fā)行走、意識水平下降。此外還可以根據腦電圖特征[27]、直接觀察腦膜微循環(huán)[28]、微透析結合高效液相色譜法[29]、組織形態(tài)學檢查[30]等來評價。

綜上所述,各種造模方法各有利弊,有不同的適用范圍。模型的建立與研究目的是解決臨床實際問題,需從不同的研究需求出發(fā),建立合適的動物模型。

[1]邵淑琴,林建,鄭彩梅.大腦中動脈缺血模型的制作進展[J].中風與神經疾病雜志,1995,12(3):185-188.

[2]K lein HJ,Nelson RJ.Advan ced PhysiologicalMonitoring in Rodents[J].ILAR J(S1084-2020),2002,43(3):121-182.

[3]Landi MS.Impact of Noninvasive Technology on Anim al Research[J].ILAR J(S1084-2020),2001,42(3):187-262.

[4]Pontén U,Ratcheson RA,Salford LG,et al.Op timal Freezing Conditions for Cerebral Metabolites in Rats[J].J Neu rochem(S0022-3042),1973,21(5):1127-1138.

[5]Garcia JH.Experim ental Ischemic Stroke:A Review[J].Stroke(S0039-2499),1984,15(1):5-14.

[6]H ossmann KA.Anim al M odels of Cereb ral Ischem ia.1.Review of Literature[J].Cerebrovasc Dis(S1421-9786),1991,1(Suppl 1):2-15.

[7]Bose B,Osterholm JL,Berry R.A Rep rodu cible Experimental M odel of Focal Cerebral Ischem ia in the Cat[J].Brain Res(S0006-8993),1984,311(2):385-391.

[8]Symon L.Experimental Model of Stroke in the Baboon[J].Adv Neu rol(S0091-3952),1975,10:199-212.

[9]Symon L,Pasztor E,Branston NM.The Distribution and Density of Reduced Cerebral Blood Flow Following Acute M iddle Cereb ral A rtery Occ lusion:An Experimental Study by the Technique of H ydrogen Clearance in Baboons[J].Stroke(S0039-2499),1974,5(3):355-364.

[10]Koizum i J,Yoshida Y,Nakazaw a T,et al.Experimental Studies of Ischemic B rain Edema.I.A New Experimental M odel of Cereb ral Embolism in Rats in Which Recirculation Can Be Introduced in the Ischemic A rea[J].Jpn J Stroke(S0039-2499),1986,8:1-8.

[11]Longa EZ,W einstein PR,Carlson S,et al.Reversible M iddle Cereb ral A rtery Occlusion without C raniectomy in Rats[J].Stroke(S0039-2499),1989,20(1):84-91.

[12]Belayev L,A lonso OF,Busto R,et al.M iddle Cereb ral A rtery Occ lusion in the Rat by Intralum inal Suture.Neu rological and Pathological Evaluation of an Im proved Model[J].Stroke(S0039-2499),1996,27(9):1616-1622.

[13]Mem ezaw a H,M inam isaw a H,SMith M L,et al.Ischemic Penum bra in a Model of Reversible M iddle Cereb ral A rtery Occlusion in the Rat[J].Exp Brain Res(S0014-4819),1992,89(1):67-78.

[14]DeV ries AC,Nelson RJ,T raystman RJ,et al.Cognitive and Behavioral Assessment in Experimental Stroke Research:W ill It Prove Usefu l[J].Neu rosci Biobehav Rev(S0149-7634),2001,25(4):325-342.

[15]Tamura A,Graham DI,M cCulloch J,et al.Focal Cerebral Ischaem ia in the Rat:1.Descrip tion of Technique and Early Neuropathological Consequences Follow ing M iddle Cereb ral A rtery Occlusion[J].J Cereb Blood Flow Metab(S0271-678X),1981,1(1):53-60.

[16]Bederson JB,Pitts LH,Tsu jiM,et al.Rat M iddle Cerebral A rtery Occlusion:Evaluation of the M odeland Development of a Neurologic Examination[J].Stroke(S0039-2499),1986,17(3):472-476.

[17]Bolander HG,Persson L,Hillered L,et al.Regional Cereb ral Blood Flow and Histopathologic Changesafter M idd leCereb ral A rtery Occ lusion in Rats[J].Stroke(S0039-2499),1989,20(7):930-937.

[18]Duverger D,M acKenzie ET.The Quantification of Cereb ral Infarction Following Focal Ischem ia in the Rat:Influence of Strain,A rterial Pressure,Blood G lu cose Concentration,and Age[J].J Cereb Blood Flow M etab(S0271-678X),1988,8(4):449-461.

[19]Shigeno T,Teasdale GM,M cCulloch J,et al.Recirculation M odel Follow ing MCA Occ lusion in Rats.Cerebral Blood Flow,Cerebrovascular Permeability,and Brain Edem a[J].J Neurosu rg(S0022-3085),1985,63(2):272-277.

[20]Chan PH,KamiiH,Yang G,et al.Brain Infarction Isnot Reduced in SOD-1 T ransgenic mice after a Permanen t FocalCereb ral Ischem ia[J].Neurorepo rt(S0959-4965),1993,5(3):293-296.

[21]Iadecola C,Sugimoto K,Niw a K,et al.Increased Susceptibility to Ischemic Brain Inju ry in Cyclooxygenase-1-deficient mice[J].JCereb Blood Flow Metab(S0271-678X),2001,21(12):1436-1441.

[22]Iadecola C,Niw a K,Nogaw a S,et al.Redu ced Suscep tibility to Ischemic B rain Inju ry and N-m ethyl-D-aspartate-mediated Neurotoxicity in Cyclooxygenase-2-deficien t mice(S0027-8424),2001,98(3):1294-1299.

[23]Dalkara T,Irikura K,H uang Z,et al.Cerebrovascular Responses under Controlled and Monitored Physiological Conditions in the Anesthetized Mouse[J].J Cereb Blood Flow Metab(S0271-678X),1995,15(4):631-638.

[24]H attori K,Lee H,Hu rn PD,et al.Cognitive Deficits after Focal Cerebral Ischemia in mice[J].Stroke(S0039-2499),2000,31(8):1939-1944.

[25]Bederson JB,Pitts LH,Tsu jiM,et al.Rat M iddle Cereb ral A rtery Occlusion:Evaluation of the Model and Development of a Neurologic Exam ination[J].Stroke(S0039-2499),1986,17(3):472-476.

[26]Longa EZ,W einstein PR,Carlson S,et al.Reversible M iddle Cereb ral A rtery Occlusion without C raniectomy in Rats[J].Stroke(S0039-2499),1989,20(1):84-91.

[27]姚謙明,何啟,湯冬旋,等.雌二醇對腦外傷大鼠腦電圖影響的實驗研究[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學生物工程學雜志,2005,11(5):392-396.

[28]王世軍,史仁華,姬廣臣,等.軟腦膜微循環(huán)研究中閉合式顱窗法的應用與體會[J].微循環(huán)學雜志,1997,7(4):21-22.

[29]M a HM,Wang ZH,Zeng Y,et al.Spectroscopic Measurements of PhysiologicalElements in microdialysis Samples from Rat Brain,Flow ering Plum Fruit and Pea[J].Chin Chem Lett(S1878-5964),1999,10(3):243-246.

[30]畢方方,田發(fā)發(fā),楊期東,等.局灶性腦缺血再灌注動物模型的制備與評價[J].中南大學學報(醫(yī)學版),2004,29(6):675-677.

R741;R743

A

1001-117X(2010)01-0053-03

10.3870/sjsscj.2010.01.015

*【基金課題】 國家自然科學基金(No.30670731)

2009-12-22