彭 超,王洪海

(1復旦大學遺傳學研究所遺傳工程國家重點實驗室,上海200433; 2江西中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院)

結核分枝桿菌抗原MPT51及其臨床應用研究進展

彭 超1,2,王洪海13

(1復旦大學遺傳學研究所遺傳工程國家重點實驗室,上海200433; 2江西中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院)

結核分枝桿菌;MPT51蛋白

近年來,結核病的發(fā)病率有升高趨勢,是人體免疫缺陷病毒(H I V)感染患者的主要死因。結核病的病原菌主要為結核分枝桿菌,隨著多耐藥結核分枝桿菌和H I V共感染的發(fā)生率增加,迫切需要研制新的疫苗和抗結核藥物以及可靠的早期診斷方法。結核分枝桿菌能分泌大量不同種類的免疫原性蛋白,其中MPT51/MPB51是主要分泌性蛋白之一,能結合纖維結合素;亦是結核病診斷和疫苗的候選蛋白之一?，F(xiàn)對MPT51的基礎研究概況及其應用進展綜述如下。

1 MPT51的結構組成及特性

1.1 MPT51基因 MPT51基因由mpt51基因編碼、900個堿基組成,其核苷酸已被克隆。MPT51基因密碼子鄰近Ag85A,但不屬于同一個操縱子。mpt51基因有自己的啟動區(qū),位于fbpA的下游區(qū),且與Ag85復合物有40%同源性?？ń槊?BCG)中的MPB51是BCG培養(yǎng)濾液中主要的分泌蛋白之一,由mpb51基因編碼。mpb51基因位于Ag85A下游,距離179 bp,編碼299個氨基酸,其中33個氨基酸是信號肽,266個氨基酸是相對分子質量為27 807.37 Da的成熟蛋白。MPB51與Ag85復合體有37%～43%的同源性,二者有2個同源性很強的區(qū)域,代表保守的功能域,位于氨基酸端的22PYENLMVPSPS MGRD IPVAFLAGGPHAV2YLLD233和內部區(qū)域的1892NNTRVWV2195。189～195區(qū)域同時亦是MPB51最輸水區(qū)域、Ag85復合物組成部分和FN結合位點。

1.2 MPT51蛋白 MPT51蛋白相對分子質量為27 kD,是結核分枝桿菌在生長過程中分泌至細胞外的主要蛋白之一,約占細胞外蛋白的15%。其在胞質溶膠和細胞表面以三聚體形式存在[1],與Ag85復合物有交叉反應,屬于同一個分泌蛋白家族。在培養(yǎng)濾液中MPT51和Ag85復合物比例是1∶3,二者既有相同又有不同的抗原決定基,在結核桿菌細胞中發(fā)揮不同作用。

MPT51蛋白的晶體結構分辨率為1.7!,與Ag85復合物中的Ag85B和Ag85C一樣,折疊成α/β水解酶。但MPT51蛋白不含有分支?；D移酶的催化三聯(lián)體(Ser2His2 Glu),且缺少α,α′2海藻糖單霉菌酸酯結合位點和活性位點,因此MPT51蛋白無分支酰基轉移酶的功能。MPT51蛋白可能是一類新的非催化性的α/β水解酶,其結構類似于某些整合素與糖結合蛋白,因此MPT51蛋白可能在宿主組織黏附上有一定作用,其配體可能包括了血清蛋白纖維結合素(FN,存在于血漿和組織中的相對高分子質量糖蛋白,在細胞發(fā)育、能動性、粘連、吞噬作用和損傷修復、炎癥反應等方面起重要作用)和小分子糖。Xolalpa等[2]研究發(fā)現(xiàn), MPT51蛋白具有結合和激活人的纖溶酶原產(chǎn)生纖維蛋白溶酶(可直接降解細胞外基質和基底膜如層粘連蛋白和纖維結合素,并間接活化基質金屬蛋白酶和彈性蛋白酶)的作用,此可能與結核分枝桿菌的侵入散播和造成組織損傷有關。

2 MPT51的臨床應用

2.1 MPT51在結核病診斷中的應用 MPT51是結核診斷的潛在生物標識物。Ramalingam等報道,MPT51對175例治療前痰涂片和培養(yǎng)陽性結核患者診斷中的敏感性和特異性分別為71%和95%。Bethunaickan等[6]研究發(fā)現(xiàn),痰涂片和培養(yǎng)陽性結核患者的血清抗MPT51的IgG、IgA和Ig M敏感率分別為57%、47%和13%,IgG特異性為98%;IgG+IgA敏感性為71%,特異性為95%;在痰涂片陰性而培養(yǎng)陽性患者中,IgG陽性率為34%;在痰涂片和培養(yǎng)陰性,X射線陽性患者中,IgG陽性率為42%。

Ramalingam等[7]研究發(fā)現(xiàn),MPT51免疫檢測在H I V21陽性患者結核早期診斷中有重要作用。Singh等[8]用臨床結核癥狀出現(xiàn)前幾個月H IV結核共感染患者的血清分析了結核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白對于亞臨床診斷的作用,約有12個抗原被上述血清所識別。其中MPT51和蘋果酸合酶(MS)能被90%的H IV結核共感染患者血清識別。表明MPT51可用于H IV陽性結核病高危人群的診斷。Wanchu等[9]研究發(fā)現(xiàn),痰涂片陽性的H IV-TB+和H IV+TB+患者的敏感性約達80%,特異性>97%。表明MPT51和MS可作為發(fā)病初期亞臨床結核患者的診斷標識物。

當MPT51蛋白與其他抗原性蛋白結合用于診斷時可提高其敏感性和特異性。MPT51和GlcB能被80%印度人的H IV陰性痰涂片陽性結核患者的血清抗體所識別。Achkar等[10]研究表明,MPT51和GlcB結合的血清學診斷可輔助痰涂片鏡檢作為肺結核快速診斷方法。Melo Cardoso等[11]報道,重組蛋白MPT51和GlcB對結核病患者血清學診斷的敏感性、特異性分別為75.5%、90.8%。Raja等[12]的實驗分析了結核分泌蛋白38 kD、30 kD及MPT51、胞質蛋白16 kD的血清學診斷作用。結果顯示MPT51檢測結核血清的敏感性和特異性均很高,特別是當MPT51、38 kD、30 kD和胞質蛋白16 kD蛋白結合診斷時,敏感性和特異性分別為91%和96%。

2.2 MPT51在結核病疫苗研制中的應用 基因疫苗是疫苗研制的第三次革命。MPT51能結合細胞外基質的FN,在宿主組織附著和毒力方面有重要作用。Ana Paula Junqueira2Kipnis小組研究發(fā)現(xiàn),感染了結核桿菌的BALB/c小鼠脾臟和肺部的MPT51特異性IFN 2γ+T淋巴細胞數(shù)量有所增加;對未感染結核桿菌的BALB/c小鼠接種 rMPT51/F IA和 rMPT51/CpGD2 NA疫苗能增加IFN 2γ+T淋巴細胞的數(shù)量;接種 rMPT51/F IA后能誘導MPT51特異性的體液反應;接種60 d后,肺組織中結核桿菌的菌落(CFU)數(shù)量減少了2個log。表明MPT51是具有潛力的DNA疫苗[13]。Yukio Koide小組還研究了編碼巨噬細胞炎癥蛋白(M IP21α)和MPT51的DNA疫苗對于誘導特異性T淋巴細胞的作用。發(fā)現(xiàn)編碼融合蛋白的DNA疫苗較僅編碼MPT51的DNA疫苗能顯著誘導小鼠產(chǎn)生更多的抗原特異性T細胞。編碼M IP21α抗原的融合蛋白DNA疫苗能通過趨化因子受體有效遞呈給抗原遞呈細胞,并誘導更高水平的抗原特異性T淋巴細胞反應[14]。

由于單核細胞增生李斯特氏菌(L.M.)能在專職抗原遞呈細胞(如巨噬細胞和樹突狀細胞)內逃離吞噬溶酶體,在細胞質中存活并繁殖,還可誘導Th1型免疫反應,因此可將外源性抗原的DNA引入L.M.構建重組L.M.活疫苗。Yukio Koide小組構建了攜帶Ag85A、Ag85B、MPB/MPT51真核表達質粒的自毀型L.M.,用該細菌重組體感染可誘導這些基因在小鼠巨噬細胞株J774A.1中的表達。C57BL/6小鼠腹膜內免疫此細菌重組體能誘導PPD特異性的細胞免疫反應如腳跟反應、脾細胞增殖反應、脾細胞IFN γ2的分泌等,顯示出此細菌重組體抗結核感染的效果。另有研究發(fā)現(xiàn),靜脈免疫此重組疫苗的BALB/c小鼠免疫保護反應強于BCG。Yukio Koide小組還用慢性病毒作為載體。研究了MPT51作為疫苗的作用,結果發(fā)現(xiàn)氣管內免疫改良后攜帶MPT51基因的第三代慢性病毒疫苗2周后,能誘導縱膈淋巴結產(chǎn)生MPT51特異的T細胞。此疫苗在肺部能產(chǎn)生MPT51特異性記憶細胞,但在淋巴結中不能。此外,MPT51慢性病毒疫苗氣管內免疫能顯著降低結核桿菌在肺部的數(shù)量。

綜上所述,MPT51是結核分枝桿菌主要的分泌蛋白和重要保護性抗原之一,在結核病診斷和新型疫苗研制方面具有重要價值。

[1]Al2sayyed B,Piperdi S,Yuan X,et al.Monoclonal antibodies to Mycobacterium tuberculosis CDC 1551 reveal subcellular localiza2 tion ofMPT51[J].Tuberculosis,2007(87):4892497.

[2]Xolalpa W,Vallecillo AJ,Lara M,et al.Identification of novel bacterial plas minogen2binding proteins in the human pathogen My2 cobacterium tuberculosis[J].Proteomics,2007(7):333223341.

[3]SuzukiM,Aoshi T,Nagata T,et al.Identification ofmurine H22 Dd2and H22Ab2restricted T2cell epitopes on a novel protective an2 tigen,MPT51,ofMycobacterium tuberculosis[J].Infect I mmun, 2004,72(7):382923837.

[4]Aoshi T,SuzukiM,UchijimaM,et al.Expression mapping using a retroviral vector forT cell epitopes:definition of a Myco2 bacterium tuberculosispeptide presented byH22Dd[J].J I mmunol Methods,2005,(298):21234.

[5]Aoshi T,Nagata T,SuzukiM,et al.Identification of an HLA2A3 02012restricted T2cell epitope on the MPT51 protein,a major se2 creted protein derived fromMycobacterium tuberculosis,byMPT51 overlapping peptide screening[J].Infect I mmun,2008,76(4): 156521571.

[6]Bethunaickan R,Baulard AR,Locht C,et al.Antibody response in pulmonary tuberculosis against recombinant 27kDa(MPT51, Rv3803c)protein ofMycobacterium tuberculosis[J].Scand J In2 fectDis,2007,39(10):8672874.

[7]Ramalingam B,Uma Devi KR,Raja A.Isotype2specific anti238 and 27 kDa(mpt 51)response in pulmonary tuberculosiswith hu2 man immunodeficiency virus coinfection[J].Scand J Infect Dis, 2003,(35):2342239.

[8]Singh KK,Dong Y,Belisle JT,et al.Antigens ofMycobacterium tuberculosis recognized by antibodies during incipient,subclinical tuberculosis[J].Clin Diagn Lab I mmunol,2005,12(2):3542 358.

[9]WanchuA,Dong Y,Sethi S,et al.Biomarkers for clinical and in2 cipient tuberculosis:perfor mance in a TB2endemic country[J]. PLoSOne,2008,3(4):e2071.

[10]Achkar JM,Dong YX,Holzman RS,et al.Mycobacterium tuber2 culosismalate synthase2and MPT512based serodiagnostic assay as an adjunct to rapid identification of pulmonary tuberculosis[J]. Clin Vaccine I mmunol,2006,13(11):129121293.

[11]Melo Cardoso Almeida C,Vasconcelos AC Jr,Kipnis A,et al. Humoral immune responses of tuberculosis patients in Brazil indi2 cate recognition of Mycobacterium tuberculosis MPT251 and GlcB [J].Clin Vaccine I mmunol,2008,15(3):5792581.

[12]Raja A,Ranganathan UD,Bethunaickan R.I mproved diagnosis of pulmonary tuberculosis by detection of antibodies against multiple Mycobacterium tuberculosis antigens[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2008,(60):3612368.

[13]Silva BD,da Silva EB,do Nascimento IP,et al.MPT251/CpG DNA vaccine protects mice against Mycobacteriumtuberculosis [J].Vaccine,2009,(27):440224407.

[14]Uchijima M,Nagata T,Koide Y.Chemokine receptor2mediated delivery of mycobacterial MPT51 protein efficiently induces anti2 gen2specific T2cell responses[J].Vaccine,2008,(26):51652 5169.

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