李子瑞

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030）

長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)引發(fā)細(xì)菌耐藥性，威脅人類健康。尋求和開(kāi)發(fā)有利于環(huán)保的新型抗菌藥物替代抗生素具有重要意義?？咕模ˋntimicrobial peptides）最初是從昆蟲(chóng)免疫后的血淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的堿性多肽類物質(zhì)，分子量很小，是一類廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)具有廣譜抗菌活性的陽(yáng)離子型多肽，是生物先天免疫的重要組成成分[1]?？咕囊淄ㄟ^(guò)環(huán)境與宿主反應(yīng)起到抗病原微生物的作用，一般不易產(chǎn)生耐藥性，現(xiàn)已成為當(dāng)前學(xué)術(shù)界中的研究熱點(diǎn)。

1 抗菌肽的概述

抗菌肽是生物體內(nèi)存在的一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，具有兩親性結(jié)構(gòu)。Boman等首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)抗菌肽，隨后從惜古比天蠶蛹中誘導(dǎo)分離并命名為天蠶素或殺菌肽（cecropin）[2]。此后，大量類似的抗菌肽被發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái)。其共同特點(diǎn)為分子量小、多聚陽(yáng)離子型和兩親性結(jié)構(gòu)?？咕闹饕擅庖呦到y(tǒng)的細(xì)胞產(chǎn)生，如多形核嗜中性白細(xì)胞（PMNs）、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞[3]。

Wang等對(duì)525種抗菌肽分析研究，發(fā)現(xiàn)抗菌肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)差異很大，含有6～84個(gè)氨基酸殘基，能與革蘭氏陰性菌的脂多糖和革蘭氏陽(yáng)性菌的磷壁酸結(jié)合，發(fā)揮抗菌作用[4]。抗菌肽在自然界分布廣泛，來(lái)源不一，有許多種不同的分類方法。Martin等按氨基酸殘基特點(diǎn)和二級(jí)結(jié)構(gòu)將抗菌肽分為4類[5]。第一類為含有半胱氨酸的兩親性的β-折疊抗菌肽。該類抗菌肽分子內(nèi)含有2～6個(gè)二硫鍵最具有代表性的是動(dòng)物防御素。其是動(dòng)物體內(nèi)防御系統(tǒng)的最大成員，可分為α、β、θ3大類。α-防御素在哺乳動(dòng)物粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中表達(dá)，β-防御素在哺乳動(dòng)物的上皮細(xì)胞中表達(dá)；第二類為含有兩親性的α-螺旋抗菌肽，此類抗菌肽N端富含堿性氨基酸殘基，C末端含有較多的疏水性氨基酸殘基，這一結(jié)構(gòu)有利于其插入細(xì)菌的質(zhì)膜。除此之外，這類抗菌肽所帶正電荷利于與細(xì)菌膜上的負(fù)電荷相互吸引而結(jié)合到細(xì)菌的細(xì)胞膜上。分子的兩端各形成一個(gè)兩親性α-螺旋，兩個(gè)螺旋之間有甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區(qū)，這種螺結(jié)構(gòu)是破壞、裂解細(xì)菌的主要結(jié)構(gòu)；第三類為含有二硫鍵的半胱氨酸環(huán)狀結(jié)構(gòu)的抗菌肽，該類抗菌肽在C末端有分子內(nèi)二硫鍵，形成一個(gè)環(huán)鏈結(jié)構(gòu)，而N末端為線狀結(jié)構(gòu)；第四類為含有1～2個(gè)氨基酸的線性伸展結(jié)構(gòu)的抗菌肽[6]。該類抗菌肽由15～34個(gè)氨基酸組成，不含半胱氨酸，但富含脯氨酸、精氨酸或色氨酸。

其中，α-螺旋和β-折疊這兩種結(jié)構(gòu)占自然界中天然抗菌肽的80%以上。這些抗菌肽具有廣譜抗菌和其他優(yōu)良的特性，如高效的抗真菌、抗病毒、原蟲(chóng)和抗腫瘤活性，這與其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)密不可分[7－8]。因此，這類抗菌物質(zhì)充分顯示了其在畜牧養(yǎng)殖上的應(yīng)用前景。

2 抗菌肽的作用機(jī)理

傳統(tǒng)抗生素的抗菌機(jī)理是與病原體上的某些特殊部位結(jié)合，破壞病原體的結(jié)構(gòu)或者阻礙其生物合成，以達(dá)到抑菌或殺菌的目的。當(dāng)作用的靶點(diǎn)改變時(shí)，病原體就會(huì)產(chǎn)生抗藥性?？咕膶?duì)真菌、病毒及發(fā)生細(xì)胞病變的真核細(xì)胞也具有抗菌作用。其抗菌作用一般不涉及特定受體，完全是陰陽(yáng)離子的相互作用，這種獨(dú)特的抗菌機(jī)理形成了不耐藥的特性[9]。盡管人們對(duì)抗菌機(jī)理已經(jīng)研究較多，但目前仍處在理論假設(shè)階段。主要有3種理論模型，包括孔洞學(xué)、可變毯模型和離子通道學(xué)說(shuō)[10]。盡管有關(guān)抗菌肽的抗菌機(jī)理研究的爭(zhēng)論比較多，目前尚無(wú)定論，但許多研究已經(jīng)證明，靜電荷、疏水性以及兩性分子性質(zhì)是調(diào)節(jié)抗菌肽活性的重要參數(shù)[11]。帶有正電荷陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)的抗菌肽與帶有負(fù)電荷細(xì)菌質(zhì)膜的磷脂表面通過(guò)靜電相互吸引而靠近，抗菌肽分子中的疏水端插入質(zhì)膜中，N端的兩親性α-螺旋也插入質(zhì)膜中，從而破壞了脂質(zhì)雙層原有的結(jié)構(gòu)，在質(zhì)膜上形成離子通道，通過(guò)改變膜的構(gòu)象，多個(gè)抗菌肽聚合在膜上形成離子通道，造成細(xì)胞內(nèi)容物泄露致細(xì)胞死亡。人們對(duì)抗菌肽與細(xì)胞膜的接觸也有許多不同的看法，一種是抗菌肽與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜上的蛋白凝聚，變性失活，形成離子通道，改變細(xì)胞膜的通透性，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡，另一種是細(xì)胞膜上存在特異受體及其他因子協(xié)助細(xì)菌死亡。目前研究?jī)A向于第一種假設(shè)。

抗菌肽對(duì)原核細(xì)胞產(chǎn)生特異的溶菌活性，對(duì)低等的真核生物如真菌及某些植物的原生質(zhì)體以及某些腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用，而對(duì)正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有作用，其原因可能是原核細(xì)胞和真核細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不同，真核細(xì)胞含有豐富的膜蛋白和膽固醇，特別是后者能夠使膜蛋白趨于穩(wěn)定，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞存在豐富的膜骨架系統(tǒng)，抵抗了抗菌肽的作用。

3 抗菌肽在畜牧生產(chǎn)上的應(yīng)用

抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對(duì)真核細(xì)胞沒(méi)有傷害作用。有望解決細(xì)菌耐藥性、抗生素的殘留及飼料添加劑等問(wèn)題。

3.1 臨床藥用及應(yīng)用

Wachinger等的研究結(jié)果表明，蜂毒素和天蠶素可以在亞毒性濃度下抑制愛(ài)滋病毒HIV-1的基因表達(dá)，減少HIV-1的增殖[12]。天蠶素、爪蛙素、鼠抗菌肽NP-1和NP-2及人抗菌肽HNP-1均表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性[13]。這可能是由于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞骨架系統(tǒng)不發(fā)達(dá)，抗菌肽易插入細(xì)胞脂膜形成離子通道，從而殺死腫瘤細(xì)胞。組蛋白衍生物P-113是一個(gè)由12個(gè)氨基酸組成的陽(yáng)離子肽，是唾液中天然抗菌肽組蛋白的結(jié)構(gòu)類似物[14]。體外試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，P-113有很好的抗白色念珠菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的作用，開(kāi)發(fā)P-113用來(lái)治療艾滋病患者口腔白色念珠菌感染的Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)已經(jīng)完成。另外P-113D也將被用于治療囊性纖維化患者肺部綠膿桿菌的感染[15]。

3.2 抗菌肽替代抗生素的研究

傳統(tǒng)的抗生素是通過(guò)阻斷生物大分子的合成來(lái)殺滅細(xì)菌的，而抗菌肽是通過(guò)裂解細(xì)菌的細(xì)胞膜使其內(nèi)容物外泄而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的，兩者的作用機(jī)理完全不同，因此，使用抗菌肽殺滅細(xì)菌不會(huì)產(chǎn)生抗藥性。

設(shè)計(jì)一種高效、有利于人類健康的抗菌肽來(lái)代替抗生素是完全可行的。溫劉發(fā)等通過(guò)在斷奶仔豬飼料中用抗菌肽代替抗生素，結(jié)果表明，抗菌肽在仔豬斷奶應(yīng)激期間抗腹瀉效果較抗生素好，適量的抗菌肽比抗生素的促生長(zhǎng)效果更理想。但高劑量的抗菌肽則降低了仔豬的生長(zhǎng)速度[16]。黃永彤等發(fā)現(xiàn)，抗菌肽有促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)和提高免疫力作用。與中草藥抗生素相比，在出欄率、平均體重、飼料效率等方面均無(wú)顯著差異，且在出欄前3 d停喂，抽檢無(wú)殘留[17]。陳曉生等研究發(fā)現(xiàn)，添加抗菌肽制劑2 mL·kg-1能有效提高1～2周齡肉鴨的生產(chǎn)性能，添加2.3 mL·kg-1可顯著提高產(chǎn)肉率[18]。添加抗菌肽會(huì)使機(jī)體在蛋白質(zhì)合成量變化不大的情況下減少機(jī)體蛋白質(zhì)的分解代謝，從而促進(jìn)生長(zhǎng)。

3.3 抗菌肽的基因工程研究

畜禽病毒性疾病對(duì)臨床工作者一直是棘手的疾病，不利于畜牧業(yè)的發(fā)展。借鑒已成功的昆蟲(chóng)抗菌肽轉(zhuǎn)基因工程，把抗菌肽基因轉(zhuǎn)入畜禽特定細(xì)胞使其真核表達(dá)，從而產(chǎn)生抗病新品種。為養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展提供新思路?？咕奶烊划a(chǎn)量低，用化學(xué)合成的方法價(jià)格昂貴，利用基因工程手段獲得無(wú)疑是目前最佳選擇，目前多種抗菌肽已在不同的表達(dá)體系中得到表達(dá)。但如何進(jìn)一步提高表達(dá)水平，提高基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性和廣譜抗菌性，都是值得深入研究的問(wèn)題。廖文艷等在大腸桿菌系統(tǒng)里表達(dá)了重組禽抗菌肽，該重組抗菌肽對(duì)大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜酸乳桿菌和枯草芽胞桿菌有抗菌活性，但對(duì)豬霍亂沙門氏菌無(wú)抗菌活性[19－20]。該重組禽抗菌肽對(duì)溫度（-70~100℃）和酸堿度（pH 3～10）有較高的穩(wěn)定性。這也暗示了這兩種重組蛋白在上述溫度和pH范圍之外仍具有抑菌活性。這些研究結(jié)果為基因工程獲得的抗菌肽作為飼料添加劑或直接口服等應(yīng)用的可能性提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，人們一直在尋找可以徹底解決耐藥性問(wèn)題的抗菌藥物，尤其當(dāng)禽流感、瘋牛病等一些動(dòng)物疑難病癥的出現(xiàn)，使人們更加渴望綠色、環(huán)?？咕幬锏某霈F(xiàn)，尋找抗生素替代品已成為必然的趨勢(shì)?？咕臑闄C(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的天然成分，具有廣譜抗菌、抗病毒和免疫增強(qiáng)的作用，并且對(duì)機(jī)體無(wú)毒害、無(wú)殘留。并且其有著獨(dú)特的不同于抗生素的抗菌機(jī)理，現(xiàn)在已完全有可能用生物工程的技術(shù)方法大量生產(chǎn)有生物活性的抗菌肽，使之成為新一代肽類抗菌藥的來(lái)源。

[1] Boman H G,Antibacterial peptides:key components needed in immunity[J].Cell,1991,65（2）:205-207.

[2] Boman H G,Nilsson L,Rasmuson B.Inducible antibacterial defense system in Drosophial[J].Nature,1972,237（5 352）:232-235.

[3] Lehrer R I,Ganz T.Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defense[J].Curr Opin Immunol,1999,11（1）:23-27.

[4] Wang Z,Wang G S.APD:the antimicrobial Peptide Data base[J].Nucile Acids Res,2004,32:590-592.

[5] Martin E,Ganz T,Lehrer R I.Defensins and other endogenous peptide antibiotics of vertebrates[J].J Leukoc Biol,1995,58:128-136.

[6] Powers J P,Hancock R E.The relationship between peptide structure and antibacterial activity[J].Peptides,2003,11:1 681-1 691.

[7] Morimoto M,Mori H,Otak T,et al.Inhibitory effect of tachyplesin I on the proliferation of human immunodeficiency virus in vitro[J].Chemotherapy,1991,37（3）:327-334.

[8] Baker M A,Maloy W L,Zasloff M,et al.Anticancer efficacy of magainin 2 and analogue peptides[J].Cancer Res,1993,53（13）:3 052-3 057.

[9] Kelley K J.Using host defenses to fight infectious diseases[J].Nature Biotechnol,1996,14（5）:587-589.

[10] Reddy K V,Yedery R D,Aranha C.Antimicrobial pep tides:premises and promises[J].Inter J Antimicrob Agents,2004,24（6）:536-547.

[11] Renato G,Margherita Z,et al.Pro-rich antimicrobial peptidesfrom animals:structure,biological functionsand mecha-nismof action current[J].Pharmaceutical Design,2002（8）:763-778.

[12] Wachinger M,Kleinschmidt A,Winder D,et al.Antimicrobial peptides melittin and cecropin inhibit eplication of human immun odeficiency virus 1 by suppressing viral gene expression[J].J GenVirol,1998,79:731-740.

[13] 周義文,尹一兵,涂植光.生物抗菌肽研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè),2004,25（2）:131.

[14] Kavanagh K,Dowd S.Histatins:antimicrobial peptides with ther Peutic potential[J].J Pharm Pharmacol,2004,56（3）:285-288.

[15] Tanabe M,Izumi H,Ise T,et al.Activating transcription factor 4Increases the cisplatin resistance of human cancer cell lines[J].Cancer Res,2003,63（24）:8 592-8 595.

[16] 溫劉發(fā),張常明,付林,等.抗菌肽制劑代替抗生素在斷奶仔豬飼糧中的應(yīng)用效果[J]．中國(guó)飼料,2001（18）:13-14.

[17] 黃永彤,黃自然,黃建清,等.抗菌肽與抗生素飼喂肉雞的效果比較[J]．廣東飼料,2004,13（2）:24-25.

[18] 陳曉生,劉為民,周慶國(guó),等.飼糧中添加抗菌肽對(duì)肉鴨血清代謝激素及生理生化指標(biāo)的影響[J].獸藥與飼料添加劑,2005,10（2）:4-6.

[19] 廖文艷,馬得瑩,劉勝旺,等.重組鴨β-防御素9基因的克隆、組織分布及其原核表達(dá)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42（4）:1 406-1 412.

[20] 廖文艷,馬得瑩,王瑞琴,等.鴨β-防御素10基因的克隆、遺傳進(jìn)化分析及其生物學(xué)特性的初步研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,40（9）:1 320-1 326.