蘇偉明,馬潤(rùn)娣,于立堅(jiān) (廣東海洋大學(xué)海洋藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江524025)

于廷曦 Cell Biology Group,Department of Surgery,Department of Pathology,University of Maryland School of Medicine and Baltimore Veterans Affairs Medical Center,Baltimore,MD 21201,USA

離子交換層析主要利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn) (pI)的差異使其分離,即在一定的緩沖體系中,不同蛋白質(zhì)與離子交換凝膠有不同的結(jié)合能力,而不同濃度的NaCl可以把不同結(jié)合力的蛋白質(zhì)從層析柱上先后洗脫下來(lái)。由于離子交換層析具有處理量大、分辨率較高和成本低廉的特點(diǎn)[1],因此,該技術(shù)在眾多蛋白質(zhì)分離中得到廣泛應(yīng)用。

福安泰-03(Fuantai-03,FAT-03)功能域從赤魟組織中分離得到,分子量大約為43000Da,具有強(qiáng)抗血管生成活性和強(qiáng)抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移作用[2～5]。將用DNA重建技術(shù)構(gòu)建的、含F(xiàn)AT-03功能域基因的質(zhì)粒整合入 BL121(DE3)大腸桿菌中,其表達(dá)的蛋白質(zhì)即重組福安泰-03功能域 (recombinant functional domain of Fuantai-03,rFAT-03)。將重組福安泰-03功能域分離純化是獲得具有實(shí)用價(jià)值產(chǎn)品的關(guān)鍵步驟。下面,筆者在20℃、上樣量一致、層析介質(zhì)相同的條件下對(duì)離子交換層析純化重組福安泰-03功能域功能域的工藝條件進(jìn)行了研究。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料

HiTrap Desalting5×5ml(17-1408-01)脫鹽預(yù)裝柱、HiT rap DEAE Sepharose FF瓊脂糖凝膠、XK 26/20柱均為美國(guó)GE公司產(chǎn)品;L-還原型谷胱甘肽 (AMRESCO公司);Tris(Genriew公司);丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、T EMED、SDS購(gòu)自北京鼎國(guó)生物廣州分公司,其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

AKTA explorer 100蛋白質(zhì)快速純化開(kāi)拓系統(tǒng) (美國(guó)GE公司);Avant J-25大容量高速冷凍離心機(jī) (美國(guó)貝克曼公司);3K30高速冷凍離心機(jī) (德國(guó)SIGMA公司);420A pH計(jì) (美國(guó)奧力龍公司);Mini trans垂直電泳槽加轉(zhuǎn)印系統(tǒng) (美國(guó)Bio-Rad公司);FR-1000凝膠成像系統(tǒng) (上海復(fù)日公司);Milli-Q RG(美國(guó)Millipore公司);2501紫外分光光度計(jì) (日本島津公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1)樣品處理 調(diào)整原液蛋白濃度為1mg/ml,上樣體積為400ml,用0.22μ m濾膜過(guò)濾,脫氣10min。

2)緩沖液的配制 上樣緩沖液 (0.1 mol/L Tris-HCl)的配制過(guò)程如下:稱取Tris 12.11g,加去離子水500ml,攪拌溶解。用0.1mol/L HCl調(diào)pH至8.8,用去離子水定容至1000ml;洗脫緩沖液(1mol/L NaCl+0.1 mol/L T ris-HCl)的配制過(guò)程如下:稱取Tris 12.11 g和NaCl 58.44 g,加去離子水500 ml,攪拌溶解。用0.1 mol/L HCl調(diào)pH至8.8,用去離子水定容至1000ml。

3)離子交換層析 采用XK26/20柱,填料為DEAE Sepharose FF瓊脂糖凝膠 (50ml),在AKTA explorer 100蛋白質(zhì)快速純化開(kāi)拓系統(tǒng)上進(jìn)行。用上樣緩沖液平衡5個(gè)柱床體積以上,至基線平穩(wěn)。通過(guò)上樣泵上樣400ml,流速8ml/min。上樣完畢后,用上樣緩沖液洗至基線平穩(wěn),再用洗脫緩沖液采用以下3種不同洗脫條件進(jìn)行洗脫:①線性梯度洗脫。即用洗脫緩沖液從0%到100%洗脫6個(gè)柱床體積,收集洗脫峰。②固定梯度和線性梯度混合洗脫。先用20%洗脫緩沖液直接洗脫3個(gè)柱床體積,再用洗脫緩沖液從20%到100%洗脫2個(gè)柱床體積,收集洗脫峰。③不同階段線性梯度洗脫。先用洗脫緩沖液從30%到60%洗脫3個(gè)柱床體積,再用洗脫緩沖液從60%到100%洗脫2個(gè)柱床體積,收集洗脫峰。

4)脫鹽 采用HiTrap脫鹽柱進(jìn)行脫鹽,上樣1ml,流速5ml/min,收集樣品。

5)總蛋白量測(cè)定 采用Lowry法[6],以牛血清白蛋白為基準(zhǔn)。

6)SDS-PAGE電泳 利用SDS-聚丙烯酰胺電泳[7]測(cè)定粗品和層析分離后樣品的純度,分離膠為10%聚丙烯酰胺凝膠,考馬斯亮藍(lán)染色。用 FR-1000凝膠成像系統(tǒng)處理SDS-PAGE凝膠。利用SMART VIEW分析軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析。

7)UNICORN 5.11軟件分析 用UNICORN 5.11軟件對(duì)離子層析圖譜進(jìn)行分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

用UNICORN 5.11軟件對(duì)離子層析圖譜進(jìn)行得率分析和SMART VIEW分析軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行純度分析,3種不同洗脫條件下的具體分析結(jié)果如下。

2.1 線性梯度洗脫

采用線性梯度洗脫時(shí),其離子交換層析圖譜如圖1(a)所示,由圖1(a)可知出現(xiàn)2個(gè)洗脫峰,1#得率只有11.16%,2#得率為88.84%。SDS-PAGE電泳圖如圖2(a)所示,由圖2(a)可知,1#峰為目的蛋白,但有雜帶,純度為90.1%,2#峰中有目的蛋白,但分離不完全。

2.2 固定梯度和線性梯度混合洗脫

采用固定梯度和線性梯度混合洗脫時(shí),其離子交換層析圖譜如圖1(b)所示。由圖1(b)可知出現(xiàn)3個(gè)洗脫峰,3個(gè)峰分離不完全,1#得率為27.73%,2#得率為11.75%,3#得率為60.51%。SDS-PAGE電泳圖如圖2(b)所示。由圖2(b)可知,1#峰為目的蛋白,純度為99.5%,2#有部分目的蛋白。

2.3 不同階段線性梯度洗脫

采用不同階段線性梯度洗脫時(shí),其離子交換層析圖譜如圖1(c)所示。由圖1(c)可知出現(xiàn)2個(gè)洗脫峰,1#和2#分離比較完全,1#得率為35.97%,2#得率為64.03%。SDS-PAGE電泳圖如圖2(c)所示。由圖2(c)可知,1#為目的蛋白,呈單一條帶,純度為99.5%,2#基本上無(wú)目的蛋白。

綜上所述,采用不同階段線性梯度洗脫時(shí),重組福安泰-03功能域和小分子物質(zhì)已完全分離開(kāi)來(lái),目的蛋白純度很高,且得率最高。因此,使用該洗脫條件可獲得最佳分離純化效果。

3 結(jié) 語(yǔ)

在上樣緩沖液為0.1mol/L Tris-HCl、洗脫緩沖液為1mol/L NaCl+0.1mol/L T ris-HCl、pH為8.8的條件下,利用HiTrap DEAE Sepharose FF瓊脂糖凝膠吸附柱,先用洗脫緩沖液從30%到60%洗脫3個(gè)柱床體積,再用洗脫緩沖液從60%到100%洗脫2個(gè)柱床體積,最后收集洗脫峰。通過(guò)上述操作能獲得最佳分離純化效果,即重組福安泰-03功能域的純度最高,得率最大。因此,該試驗(yàn)條件的確定為制備足量高純度重組福安泰-03功能域提供了重要參考。

圖1 離子交換層析圖譜

圖2 SDS-PAGE電泳圖

[1]薛文嬌,范代娣,尚龍安,等.離子交換批量層析純化重組類人膠原蛋白 [J].化學(xué)工程,2006,34(11):8～11.

[2]蘇偉明,馬潤(rùn)娣,于立堅(jiān),等.一種新的源自赤魟的強(qiáng)血管生成抑制劑福安泰-03的分離和鑒定 [J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2009,25(9):849～854.

[3]于立堅(jiān),馬潤(rùn)娣,廖銘能,等.福安泰-03對(duì)腫瘤血管生成的抑制作用 [J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2008,24(11):1445～1449.

[4]廖銘能,徐海瑛,馬潤(rùn)娣,等.福安泰-03對(duì)高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM侵襲能力的影響 [J].細(xì)胞生物學(xué)雜志,2009,31:384～388.

[5]黃來(lái)珍,王長(zhǎng)秀,馬潤(rùn)娣,等.福安泰-03對(duì)小鼠癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和轉(zhuǎn)移行為的影響 [J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2010,32(4):223～228.

[6]Lowry O H,Rosebrough N J,Farry A L,et al.Protein measurement with the folin phenol reagent[J].J Biol Chem,1951,193:265～275.

[7]李建武,余瑞元,袁明秀,等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法 [M].北京:北京大學(xué)出版社,1994.