肖 蘞 ，張?jiān)鰳s ，黃 毅 ，劉益平 ，朱 慶

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川省南充市畜牧局，四川 南充 637100）

本試驗(yàn)以四川山地烏骨雞為研究對(duì)象，利用SYBR GreenⅠ熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法，以雞CAPN 1基因的定量研究為切入點(diǎn)，闡明CAPN 1基因?qū)∪饽鄱鹊淖饔脵C(jī)制。通過(guò)分析鈣蛋白酶系統(tǒng)與雞肉質(zhì)密切相關(guān)的功能基因（CAPN 1基因）在不同組織的表達(dá)差異，探索CAPN 1基因表達(dá)的發(fā)育性變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究該基因?qū)?yōu)質(zhì)肉雞嫩度的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和采樣 以四川農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的山地烏骨雞品種為試驗(yàn)對(duì)象。試驗(yàn)雞只數(shù)量500只，雞群在相同條件下飼養(yǎng)，分別于 1d、14d、28d、42d、56d、70d和84d每個(gè)時(shí)間段屠宰6只。屠宰后取胸肌、腿肌、肝臟、心、大腦組織樣品，置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，于-70℃冰箱中保存，用于總RNA提取。然后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，分析組織CAPN 1 mRNA豐度。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 參照熒光實(shí)時(shí)定量PCR SYBR GreenⅠ法引物設(shè)計(jì)要求，根據(jù)雞CAPN 1的DNA序列（GenBank 登錄號(hào)∶NC_006090.1），雞 Beta-actin基因（內(nèi)參）全序列（Genbank登錄號(hào)：NC_006090.1），利用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)雞CAPN 1、Beta-actin基因特異引物。CAPN 1引物為 F：5′-GCCAACAGAGAGAAGA TGACAC-3′，R：5′-GTAACACCATCACCAGAGTCCA-3′，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為116bp，退火溫度57℃；Beta-actin引物為 F∶5′-GCCAACAGAGAGAAGATGACAC-3′；R∶5′-GTAACACCATCACCAGAGTCCA-3′，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為140bp，退火溫度57℃。

1.3.2 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 總RNA提取按Trizol Reagent Kit提供的方法進(jìn)行,并采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度（OD260/OD280=1.8～2.0）。使用SYBRRPrime ScriptTMRT-PCR Kit中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑合成cDNA，反應(yīng)試劑和條件見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.3 樣品的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

1.3.3.1 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) RT-PCR產(chǎn)物用Gel Extraction Mini Kit回收，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后10倍體系稀釋?zhuān)糜跇?gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。取1μL稀釋10-3倍再逐級(jí)稀釋至10-10倍，以稀釋后的PCR產(chǎn)物作模板，按照定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。每例樣品及陰性對(duì)照均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，取均值。反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)得出熒光反應(yīng)曲線(xiàn)。

1.3.3.2 反應(yīng)體系及條件 利用反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA分別做目的基因（CAPN 1）PCR和內(nèi)參基因（Betaactin）的定量PCR。根據(jù)所設(shè)計(jì)合成的目的基因和內(nèi)參基因上游、下游引物給定的Tm值優(yōu)化退火溫度。實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系為 25 μL，其中SYBRRPremix EX TaqTM（2×）12.5 μL、cDNA 2.0μL、上游引物（10μM）0.5μL、下游引物（10μM）0.5 μL、dH2O 9.5 μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，于實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：95℃ 3min熱啟動(dòng)HotStar Taq酶活性；94℃ 5s、57℃ 30s，共50個(gè)循環(huán)；95℃ 1min、55℃ 1min，55～95℃每 30s升高 0.5℃（共 81個(gè)循環(huán)）進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析，16℃保存。陰性對(duì)照以無(wú)RNA酶的水代替cDNA模板。反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)得出熒光反應(yīng)曲線(xiàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理 利用Excel 2003統(tǒng)計(jì)各樣品Ct值，參照Kenneth（2001）的方法計(jì)算目的基因在樣品與對(duì)照品間表達(dá)差異的倍數(shù)。

其中，Rel.Quantity表示目的基因在樣品與對(duì)照品間表達(dá)差異的倍數(shù)；GOI表示目的基因；NORM表示內(nèi)參基因；Eff表示PCR擴(kuò)增效率。

利用SPSS12.0 For Windows軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示，CAPN 1基因各相對(duì)表達(dá)量的差異用One-way ANOVA（單因素方差分析）進(jìn)行分析，并進(jìn)行Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAPN 1和Beta-actin基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 以山地烏骨雞總RNA為模板，用所設(shè)計(jì)的CAPN 1和Beta-actin引物分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別獲得116bp和140bp的條帶。兩個(gè)基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、明亮、無(wú)雜帶，說(shuō)明可以利用這兩對(duì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。測(cè)序結(jié)果與GenBank所提供序列的一致性達(dá)100%，為目的基因片段。

2.2 目的基因與內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和溶解曲線(xiàn)CAPN 1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在模板濃度梯度為10-3～10-10的范圍內(nèi)構(gòu)建，對(duì)應(yīng)Ct值為9.34～30.99，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：Y=-3.321X+2.658，一致系數(shù) R2=0.988，Eff=100%；Beta-actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在模板濃度梯度為10-3～10-10的范圍內(nèi)構(gòu)建，對(duì)應(yīng)Ct值為6.34～28.34，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：Y=-3.564X-4.006，一致系數(shù) R2=0.981，Eff=90.8%。其中，Y為Ct值，X為模板量的對(duì)數(shù)值。兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擴(kuò)增效率在理想的90%～105%范圍內(nèi)。

2.3 相對(duì)定量PCR結(jié)果

2.3.1 山地烏骨雞CAPN 1 mRNA的組織表達(dá)差異以各時(shí)間點(diǎn)腿肌平均Ct值為對(duì)照，計(jì)算各組織CAPN 1基因的相對(duì)表達(dá)量（表1）。結(jié)果表明：除了1d、28d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)以外，5個(gè)組織中的基因表達(dá)量均為肌肉（腿肌、胸?。拘模灸X＞肝。多重比較結(jié)果顯示：在1d、14d，腿肌顯著高于肝（P＜0.05）；在28d，胸肌極顯著高于其他各組織（P＜0.01），心極顯著高于腦、肝（P＜0.01），腿肌極顯著高于肝（P＜0.01），腿肌顯著高于腦（P＜0.05）；在 42d，胸肌極顯著高于肝、心、腦（P＜0.01），顯著高于腿?。≒＜0.05）；在 56 d，胸肌極顯著高于肝（P＜0.01），顯著高于腦（P＜0.05），腿肌顯著高于肝（P＜0.05）；在70 d，胸肌極顯著高于肝、心、腦（P＜0.01），腿肌顯著高于肝、腦（P＜0.05）；在 84 d，腿肌極顯著高于肝（P＜0.01），顯著高于心、腦（P＜0.05），胸肌顯著高于肝（P＜0.05）。

表1 四川山地烏骨雞5個(gè)組織CAPN 1基因的相對(duì)表達(dá)量 倍

2.3.2 山地烏骨雞CAPN 1 mRNA在不同組織中的發(fā)育性表達(dá) 山地烏骨雞的5個(gè)組織在各時(shí)間點(diǎn)其CAPN 1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均以84 d樣品平均Ct值為對(duì)照（表2）。結(jié)果表明：腿肌中CAPN 1基因的表達(dá)量在42d前變化很小，隨后逐漸升高，在52 d達(dá)到較高表達(dá)量，70d有所回落，最后在84d達(dá)到最高點(diǎn)，其中84 d極顯著高于其他各時(shí)間點(diǎn)（P＜0.01），56 d顯著高于 1 d、42 d（P＜0.05）；胸肌組織中 CAPN 1 基因的表達(dá)規(guī)律和腿肌組織中該基因的表達(dá)規(guī)律基本一致，隨著日齡增加而上升并在84 d達(dá)到最高點(diǎn)，但在42 d和70d有所回落，其中84d、56d顯著高于1d（P＜0.05）；肝臟組織在1d最低，42d最高，各時(shí)間點(diǎn)間差異不顯著（P＞0.05）；心在1d最低，28d最高，各時(shí)間點(diǎn)間差異不顯著（P＞0.05）；腦在 42d最低，56 d最高，各時(shí)間點(diǎn)間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 四川山地烏骨雞5個(gè)組織中CAPN 1基因的發(fā)育性變化 倍

3 討論

本試驗(yàn)所采集的山地烏骨雞的胸肌、腿肌、心、腦、肝組織樣本中（1～84d），均檢測(cè)出CAPN 1基因表達(dá)，且表達(dá)量較高（Ct值在20.65～30.4之間），這進(jìn)一步證實(shí)了該蛋白酶在雞細(xì)胞內(nèi)是普遍存在的，并參與機(jī)體的生長(zhǎng)與代謝過(guò)程。

通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)的表達(dá)量進(jìn)行比較分析可以看出，除了1日齡和28日齡，其余各時(shí)間點(diǎn)肌肉組織（胸肌和腿?。┚鶠閮?yōu)勢(shì)組織，5個(gè)組織中的基因表達(dá)量均為肌肉（腿肌、胸?。拘模灸X＞肝。Ilian利用核糖核酸酶保護(hù)法定量測(cè)定CAPN 1基因mRNA在牛和羊各組織中的表達(dá)量，得出：骨骼?。拘模靖?。劉安芳等利用半定量RT-PCR的方法，檢測(cè)了4個(gè)品種雞的10個(gè)組織中均有CAPN 1基因mRNA的表達(dá)，其中胸?。靖危灸X＞心。不同試驗(yàn)結(jié)果雖有所差異，但均發(fā)現(xiàn)在肌肉組織中為高表達(dá)，證實(shí)了該基因可能是影響雞肌肉增長(zhǎng)和嫩度的主效基因或與主效基因連鎖。

Morgan等研究認(rèn)為，CAPN 1是肉嫩化的基本酶類(lèi)，鈣蛋白酶體系是導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解、嫩度提高的關(guān)鍵酶，CAPN 1基因表達(dá)量與肌肉嫩度的關(guān)系呈正相關(guān)。大量資料報(bào)道表明：肌纖維直徑越小、密度越大，肉質(zhì)就越嫩。在優(yōu)質(zhì)肉雞研究中我們發(fā)現(xiàn)，隨著日齡增加其纖維直徑逐漸變大、密度逐漸降低，尤以56～84d變化明顯。本試驗(yàn)在研究各組織發(fā)育性表達(dá)中，發(fā)現(xiàn)胸肌和腿肌的發(fā)育性模式非常相似：CAPN 1基因表達(dá)量在42 d后隨著日齡增加有增長(zhǎng)的趨勢(shì)。在雞發(fā)育中后期肌肉相對(duì)增長(zhǎng)減小，單位面積內(nèi)的肌纖維直徑也變小，相應(yīng)的肌纖維密度增大，而肌肉密度與肌肉嫩度是呈正相關(guān)的，由此得出CAPN 1基因在肌肉組織中的表達(dá)量與雞肌肉組織的生長(zhǎng)發(fā)育呈相似的變化規(guī)律。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量方法首次測(cè)定了CAPN 1基因在山地烏骨雞5個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量，獲得了該基因在各組織中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果表明：CAPN 1基因在各階段均有表達(dá)，且表達(dá)具有組織差異性，肌肉組織為優(yōu)勢(shì)組織；CAPN 1基因在肌肉組織中的表達(dá)量與雞肌肉組織的生長(zhǎng)發(fā)育呈相似的變化規(guī)律。

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