夏俊霞 喬福元 蘇放明 龔 洵 李小恒

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科,武漢 430030

2暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院產(chǎn)科,深圳 518020

3深圳市疾病預(yù)防控制中心分子生物學(xué)研究室,深圳 518020

子癇前期(preeclampsia,PE)是妊娠期特有的原因不明的多系統(tǒng)疾病,迄今仍然是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡的重要原因,其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)目前認(rèn)為與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降密切相關(guān)[1]。骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種多功能的細(xì)胞因子和黏附蛋白,在介導(dǎo)細(xì)胞分化、黏附、增殖與遷移、免疫調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥及對感染性疾病的免疫能力等方面有著重要的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3-4]OPN是影響子宮-胚胎微環(huán)境的重要因素,其在滋養(yǎng)細(xì)胞、胎盤上都有表達(dá),通過與整合素受體結(jié)合,調(diào)節(jié)絨毛侵入、介導(dǎo)細(xì)胞遷移和胎盤形成,參與母胎界面的免疫調(diào)節(jié),與子癇前期的發(fā)病關(guān)系密切。本研究通過比較OPN蛋白及mRNA在子癇前期患者胎盤組織中的表達(dá)水平變化,探討其在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取深圳市人民醫(yī)院產(chǎn)科 2008年 11月至2009年10月住院分娩的PE患者25例,其中輕度PE患者10例(輕度PE組),重度PE患者15例(重度PE組)及正常孕婦20例(對照組),均為單胎妊娠。輕度PE組、重度PE組和對照組的年齡分別為22～ 34(29.8±4.1)歲、21～37(30.3±4.1)歲 、20～36(28.9±4.2)歲;孕周分別為 34+3～41+3(37.8±1.8)周、34+1～41+2(37.6±2.0)周、36～41+5(38.3±1.5)周,3組年齡、孕周差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照全國高等醫(yī)學(xué)院校教材《婦產(chǎn)科學(xué)》第6版[5],排除有高血壓、糖尿病、心臟病、免疫系統(tǒng)疾病、肝腎疾病等慢性疾病史的孕婦。

1.2 標(biāo)本處理

胎盤娩出后迅速取胎盤中央絨毛豐富部位母體面胎盤組織3～4塊,避開出血、壞死、鈣化的部位,每塊大小約1.0 cm×1.0 cm×1.5 cm(深度達(dá)到1 cm以上),用生理鹽水沖洗后,迅速置于液氮中,所有操作5 min內(nèi)完成。過夜后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ砣⌒迈r胎盤約1.0 cm×1.0 cm×1.5 cm小塊置于4%多聚甲醛中固定,用于免疫組化測定。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)方法(SP法)檢測胎盤組織OPN蛋白的表達(dá) 將4%多聚甲醛固定的胎盤組織小塊予以常規(guī)組織脫水、透明、石蠟包埋后切片,片厚5 μ m,每個(gè)組織塊取3張,用于以下SP法免疫組織化學(xué)染色。主要步驟為:鼠抗OPN單克隆抗體(1∶400,Santa Cruz,美國)室溫孵育切片過夜;生物素化兔抗鼠IgG(1∶200,北京中山)室溫孵育1 h;以DAB/H2O2顯色。蘇木精輕度復(fù)染。用抗體稀釋液替代一抗進(jìn)行陰性對照,反應(yīng)呈陰性。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)觀察照相,運(yùn)用Image-Pro Plus Version 5.1彩色圖像分析系統(tǒng),對每張切片的OPN免疫反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行吸光度值測定,并進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2 Western blot方法檢測胎盤組織OPN蛋白的表達(dá)水平 約100 mg胎盤組織加入1 mL細(xì)胞裂解液勻漿,離心15 min取上清,電泳分離蛋白樣品,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜到NC膜上,行免疫印跡反應(yīng)。用鼠抗OPN單克隆抗體(1∶1 000,Santa Cruz,美國)4℃過夜,同時(shí)以鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶2 000,Santa Cruz,美國)作為內(nèi)參照;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗鼠IgG(1∶2 000,北京中山)室溫孵育2 h;NC膜用DAB/H2O2顯色,掃描儀上掃描結(jié)果。運(yùn)用生物電泳圖像分析系統(tǒng)(復(fù)日Smartview2001,S/N:SV-0002202,日本)對條帶進(jìn)行吸光度值分析。以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的平均吸光度的比值表示目的蛋白水平。

1.3.3 胎盤組織RNA的提取與半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 100 mg胎盤組織按Trizol法(試劑盒購自 Invitrogen,美國)提取總 RNA。OPN mRNA水平通過 RT-PCR方法檢測。用βactin作為內(nèi)參照同時(shí)擴(kuò)增。引物均根據(jù)GenBank登錄的人目的基因cDNA序列,由上海英駿公司設(shè)計(jì)并合成。OPN:上游引物 5′-CGA CGA TGA TGA CGA TGA TGA T-3′;下 游引 物 5′-CTG GCT T TG GAA CTT GCT TGA C-3′;β-actin:上游引物 5′-TCA CCA T TC GGA TGA GTC TG-3′;下游引物 5′-ACT TGT GGC TCT GAT GT T CC-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為498 bp和 386 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)(復(fù)日 Smartview2001 S/N:SV-0002202,日本)對條帶進(jìn)行吸光度值分析。以目的基因與內(nèi)參照β-actin的平均吸光度的比值表示OPN mRNA水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胎盤組織中OPN免疫反應(yīng)性的表達(dá)

OPN蛋白在對照組和PE各組胎盤組織中均有表達(dá),可見到OPN免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為棕褐色顆粒狀或點(diǎn)狀,主要表達(dá)定位于胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中,并且胎盤毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有大量的表達(dá)。OPN免疫反應(yīng)產(chǎn)物吸光度測定分析結(jié)果如下:對照組(0.99±0.08),輕度 PE組(0.63±0.06),重度PE組(0.34±0.06)。與對照組相比,PE各組胎盤組織中OPN的免疫陽性染色均明顯變淺,平均吸光度值減小(均P＜0.05),即PE各組胎盤組織中OPN蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而重度PE組與輕度PE組相比,OPN的免疫陽性染色更淺(P＜0.05),即重度PE組胎盤組織OPN的蛋白表達(dá)低于輕度PE組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 OPN在各組胎盤組織中免疫反應(yīng)性的表達(dá)分布(SP法,×400)Fig.1 Distribution of OPN immunoreactivity in placenta(SP method,×400)

2.2 對照組和PE各組胎盤組織OPN蛋白表達(dá)水平比較

OPN和β-actin的蛋白分子量分別為45 kD和42 kD,以β-actin為內(nèi)參照,對各組條帶的吸光度值進(jìn)行校正后分析。Western blot檢測各組胎盤組織OPN蛋白表達(dá)結(jié)果如下:對照組(1.65±0.11),輕度PE組(1.19±0.15),重度 PE組(0.61±0.10)。單因素方差分析結(jié)果表明,PE各組胎盤組織OPN的蛋白表達(dá)量均明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),同時(shí)重度PE組的OPN的蛋白表達(dá)量較輕度PE組顯著降低(P＜0.05)。見圖2。

圖2 Western blot分析顯示胎盤組織OPN蛋白表達(dá)水平Fig.2 Detection of the OPN protein expression in placenta by Western blot

2.3 對照組和PE各組胎盤組織OPN mRNA水平比較

OPN和β-actin的mRNA擴(kuò)增片段長度分別為498 bp和386 bp,條帶清晰。以β-actin作為內(nèi)參照,對各組條帶的吸光度值進(jìn)行校正后分析。各組胎盤組織OPN mRNA水平RT-PCR分析結(jié)果如下:對照組(1.01±0.08),輕度 PE組(0.71±0.07),重度PE組(0.39±0.06)。與對照組相比,PE各組胎盤組織OPN mRNA表達(dá)明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),其中重度PE組OPN mRNA表達(dá)顯著低于輕度PE組(P＜0.05)。見圖3。

圖3 RT-PCR分析顯示胎盤組織OPN mRNA水平Fig.3 T he expression of OPN mRNA in placenta detected by RTPCR

3 討論

3.1 子癇前期(PE)的相關(guān)病因及病理生理研究

PE是妊娠期特有的危害母嬰健康的多系統(tǒng)疾病,發(fā)病率約為5%,是導(dǎo)致圍生期死亡的主要并發(fā)癥。臨床上,PE表現(xiàn)為母體綜合征(高血壓、蛋白尿伴或不伴有多器官系統(tǒng)的損傷),可伴有胎兒綜合征(胎兒生長受限、胎兒窘迫、圍產(chǎn)兒患病率及死亡率增高等)[1,6]。近百年來國際醫(yī)學(xué)界形成了PE病因的多種學(xué)說,如:滋養(yǎng)層淺表植入學(xué)說、胎盤血管損傷學(xué)說、免疫學(xué)說、凝血與纖溶系統(tǒng)失調(diào)學(xué)說、基因遺傳學(xué)說、腎素-血管緊張素-醛固酮學(xué)說、前列腺素系統(tǒng)學(xué)說等等。近年來,越來越多的學(xué)者傾向于認(rèn)同滋養(yǎng)層淺表植入學(xué)說,即滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致PE發(fā)生。病理生理學(xué)研究表明[1,6]:滋養(yǎng)細(xì)胞分化異常導(dǎo)致浸潤表淺,螺旋動(dòng)脈重鑄失敗和胎盤淺著床;血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷;過度的炎性反應(yīng)是PE重要的特征性病理生理變化。雖然滋養(yǎng)細(xì)胞分化異常導(dǎo)致浸潤表淺,螺旋動(dòng)脈重鑄失敗被認(rèn)為是PE起始性的病理生理變化,但引起滋養(yǎng)細(xì)胞分化異常原因和機(jī)制尚不清楚。這也是PE病因至今不能明確的主要原因。學(xué)者們推測母胎界面的免疫失衡或滋養(yǎng)細(xì)胞基因的異常表達(dá)是導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞分化異常的根本原因[1,6]。新近的研究提示,滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜免疫細(xì)胞信號傳遞異常與滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤異常、胎盤淺著床有關(guān)[7]。

3.2 骨橋蛋白(OPN)的分子生物學(xué)特征及功能

OPN是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組分,是一種富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)三肽序列的分泌型鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白,廣泛存在于各種組織和體液中,具有多種生物學(xué)活性[3-4]。

目前已知OPN分子中存在有凝血酶和部分基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的作用位點(diǎn)。OPN能夠通過活化的κ B抑制蛋白酶/κ B抑制蛋白酶激酶(Iκ Ba/IKK)信號途徑促進(jìn)MMP-2前體的活化[8]。MMPs與其組織抑制物(TIMPs)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡在人體內(nèi)許多涉及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解和重建的生理、病理過程中,如炎癥、胚胎發(fā)生和著床、胎盤血管床的重塑、血管形成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、滋養(yǎng)細(xì)胞侵入等發(fā)揮重要作用[9]。OPN主要的生物學(xué)功能有:①介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用;②介導(dǎo)細(xì)胞的趨化、聚集、黏附、增殖和遷移;③參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)。細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中,OPN是最重要的也是最早起作用的細(xì)胞因子,故OPN曾被稱為早期T淋巴細(xì)胞活化因子1(Eta-1)[10];④刺激鈣轉(zhuǎn)運(yùn),參與鈣質(zhì)沉積;⑤激活磷脂酰肌醇激酶-3,并激活多種MMPs;⑥影響組織生物礦化與重建;⑦促進(jìn)血管生成;⑧控制炎癥的發(fā)生與發(fā)展;⑨參與神經(jīng)發(fā)育;⑩參與癌細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移[11-12]等過程。

近年生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究[3-4]表明,OPN是子宮和胎盤免疫細(xì)胞的產(chǎn)物并可調(diào)節(jié)它們的活動(dòng)和細(xì)胞因子的生成,是子宮-胎盤微環(huán)境的重要組成部分;OPN不僅參與母胎界面黏附,調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,調(diào)節(jié)絨毛的侵襲,亦參與母胎界面免疫調(diào)節(jié)。故OPN幾乎參與了生殖的全過程。

3.3 OPN在PE發(fā)病機(jī)制中的可能作用

近年研究發(fā)現(xiàn)[13-15]在PE患者胎盤組織中多種參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白如OPN 、Src、paxillin、Crb2、Cas、PI-3K 及 STAT 等表達(dá)異常,蛋白表達(dá)量或活性較正常胎盤組織顯著下降。本研究結(jié)果顯示,OPN蛋白在對照組和PE組胎盤組織中均有表達(dá),OPN表達(dá)主要定位于胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中,并且在胎盤毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中亦有大量的表達(dá)。PE組胎盤組織中OPN的蛋白表達(dá)量和mRNA水平均明顯低于對照組,且隨PE病情加重,OPN的蛋白表達(dá)量和mRNA水平進(jìn)一步顯著降低,與我們前期的研究結(jié)果一致[13]。Batorfi等[16]研究指出在正常妊娠,OPN對滋養(yǎng)層生長和侵入的調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過程,妊娠相關(guān)疾病(如子癇前期、胎兒生長受限、自然流產(chǎn)、葡萄胎等)中這種調(diào)節(jié)被改變,其發(fā)病機(jī)制可能與OPN的下調(diào)有一定關(guān)系。Raffetto等[17]研究表明PE的發(fā)生與MMPs/T IMPs系統(tǒng)失衡密切相關(guān),而OPN可通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)MMPs/T IMPs系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。由此我們推測胎盤組織中OPN的低表達(dá)在PE發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用,OPN的表達(dá)降低改變了子宮-胎盤微環(huán)境及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,引發(fā)母胎界面免疫失衡,導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力不足及淺浸潤,螺旋動(dòng)脈重鑄失敗,胎盤淺著床,從而引發(fā)PE;OPN的低表達(dá)還可能通過打破MMPs/T IMPs間的平衡,參與過度的炎癥反應(yīng),以及其它未知途徑誘導(dǎo)PE的發(fā)生。但是OPN在PE發(fā)病機(jī)制中的具體作用,及其究竟是PE的原因還是疾病的結(jié)果,均有待深入研究。

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