劉志東,郭本恒,王蔭榆*,李云飛,劉振民,王建飛

1上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,上海 200240;2光明乳業(yè)技術(shù)中心,乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室上海 200436;3上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240

正常情況下,機體內(nèi)活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)等的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。但當(dāng)機體受到某些異常的理化因素刺激或處于病理狀態(tài)時,可產(chǎn)生大量的 ROS,致使機體的氧化還原平衡遭到破壞,過量的 ROS可引起脂質(zhì)過氧化,DNA和蛋白質(zhì)損傷與多種慢性疾病如癌癥、衰老、動脈粥樣硬化及神經(jīng)系統(tǒng)的疾病[1]?？寡趸瘎┠軌蜣卓贵w內(nèi)過量的自由基,阻止 ROS誘導(dǎo)的細胞損傷,避免組織受到氧化傷害,從而預(yù)防相關(guān)疾病的發(fā)生[2,3]。由于紅細胞膜富含大量多不飽和脂肪酸,因而易受活性氧自由基(ROS)等的攻擊而發(fā)生過氧化反應(yīng),引起紅細胞結(jié)構(gòu)和功能的改變,如MDA的生成,膜脆性的增加,膜內(nèi)外離子濃度的電化學(xué)梯度喪失等,最終導(dǎo)致紅細胞溶血的發(fā)生。所以,紅細胞常作為氧化應(yīng)激的模型來評估未知物的抗氧化活力。

由于各種體系之間差別較大,其抗氧化活性也可能有所不同,所以有必要研究不同的生物體系之間是否也存在相同的抗氧化效果。本文研究了抗氧化肽 A對人肺癌細胞 A549,紅細胞氧化性溶血和肝組織勻漿氧化性損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

抗氧化肽 A,根據(jù)本實驗室發(fā)現(xiàn)的乳抗氧化肽合成(純度≥95%);人肺癌細胞 A549,國家新藥篩選中心;Wistar大鼠,上海斯萊克實驗動物有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗氧化肽 A對人肺癌細胞 A 549的影響

采用 MTT法測定抗氧化肽對人肺癌細胞 A549的抑制作用[4]。取對數(shù)生長期的腫瘤細胞,用0.25%胰酶消化后,加入 96孔細胞培養(yǎng)板(每孔含細胞約 1×105個),80μL/孔,置于 37℃,5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),癌細胞為貼壁生長。培養(yǎng)48 h后 ,每孔內(nèi)分別加入 0.016、0.063、0.250、1.000、4.000mM的抗氧化肽 10 μL/孔;不加樣品的細胞培養(yǎng)液為對照組,每組設(shè) 3個復(fù)孔。每孔加入 5 mg/mL的 MTT溶液 10μL培養(yǎng) 4 h。然后吸去上清,每孔加入 100μL的 DMSO,輕輕震蕩 10 min,在 570 nm波長處用酶標儀測定各孔的吸收值,取平均值計算抑制率。

細胞抑制率 =(OD對照組 -OD劑量組)/對照組 OD×100%(1)

1.2.2 大鼠紅細胞懸浮液的制備及氧化性溶血抑制率的測定

Wistar大鼠用 10%烏拉坦腹腔注射麻醉、自頸動脈取血。用 3%枸櫞酸鈉抗凝,0.9%NaCl稀釋,3000×g,0℃離心 10 min分離得到紅細胞,滅菌生理鹽水洗滌三次后,以生理鹽水配成 0.5%的懸浮液。取紅細胞懸浮液 5mL與 0.2mL不同濃度的樣品混合,于 37℃溫育 24 h(對照管以蒸餾水代替樣品液)。然后以生理鹽水稀釋 5倍,1000×g離心 10 min取上清液,于 540 nm處比色,根據(jù)吸光度計算抑制率[5]。公式如下:

溶血抑制率(%)=(1-樣品管吸光度/對照管吸光度)×100%(2)

1.2.3 大鼠肝組織勻漿丙二醛(MDA)生成的影響

取小鼠肝組織 1.0 g,用冰冷的生理鹽水漂洗后,濾紙吸干,稱重。置于 5 mL小燒杯中,量取 9倍于體積塊體積的生理鹽水,將 2/3的生理鹽水倒入燒杯中,以眼科剪迅速剪碎組織塊,再將剪碎的組織連同生理鹽水一起倒入玻璃勻漿器中,然后用剩余的生理鹽水沖洗燒杯和眼科剪,并倒入勻漿器,勻漿6～8 min,使組織勻漿化,整個過程應(yīng)置于冰浴中完成。勻漿完全后將勻漿液以 3000～4000 r/min離心10～15min,上清液即為肝組織勻漿液。

于試管中加入 10%的小鼠肝組織勻漿液 0.20 mL及不同濃度的樣品 0.10m L,對照加等體積生理鹽水。37℃溫育 1 h后取出,冰浴冷卻,按MDA測定試劑盒中方法操作,由于 MDA與硫代巴比妥酸縮合形成的紅色產(chǎn)物在 532 nm處有最大吸收,因此在該波長下測定吸光度,計算其 MDA含量。公式如下,其中勻漿液蛋白含量測定以牛血清白蛋白為標準,采用 Lowry法[6]。

組織中 MDA含量 =(OD實驗管 -OD空白管)×標準濃度 ÷蛋白含量 (3)

另取兩組試管,一組先加入 10mmol/L的 H2O20.10 mL,另一組先加入 lmM的 FeSO40.10mL,然后再按前述方法,向這兩組試管加入組織勻漿和樣品液,溫育,冷卻,測定 MDA的含量[7]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用 SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行處理,結(jié)果以 x±s表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化肽 A對人肺癌 A549細胞生長的影響

表 1 抗氧化肽對A549細胞生長的影響(n=3)Table 1 Effect of the antioxidant peptide on the growth of A549 cell(n=3)

細胞的持續(xù)分裂和增殖是癌細胞的一個重要特征。因此考察對腫瘤細胞增殖的抑制作用是鑒定外源性物質(zhì)抗腫瘤作用的一個基本指標。研究表明生物活性肽對非內(nèi)分泌性實體腫瘤如肝癌、肺癌[8-10]的生長具有抑制作用,其抗腫瘤效應(yīng)和抗氧化效應(yīng)逐漸為人們所認識。K.D.Kent等[11]研究了乳清分離蛋白(WPI)酶解物對細胞內(nèi)谷胱甘肽和人前列腺上皮細胞氧化致死的影響。結(jié)果表明 WPI酶解物能促進細胞內(nèi)谷胱甘肽的合成并保護因氧化引起的人前列腺上皮細胞的死亡。肺癌是最常見的呼吸道惡性腫瘤之一,人肺癌 A549細胞是具有旺盛的增殖能力的低分化肺癌細胞株。因此,本實驗采用人肺癌 A 549細胞為靶細胞探討抗氧化肽 A對 A549的抑制作用。實驗結(jié)果表明,不同濃度的抗氧化肽A對 A549細胞生長均有抑制作用;1.00 mg/m L的抗氧化肽作用于 A549細胞后,其抑制率可達81.66%。結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)的研究,我們認為抗氧化肽對腫瘤的抑制機制可能是通過受體介導(dǎo)和非受體介導(dǎo)途徑兩種途徑[12-15]。但具體是以哪種途徑為主或兩種途徑如何相互作用還有待進行深入的研究。

2.2 抗氧化肽 A對大鼠紅細胞氧化性溶血的影響

機體內(nèi)的紅細胞具有運輸 O2及 CO2的作用,其膜內(nèi)的血紅蛋白使其功能的發(fā)揮成為可能。但如果紅細胞膜被破壞,其內(nèi)部的血紅蛋白外溢,紅細胞的轉(zhuǎn)運功能便喪失。紅細胞不僅在體內(nèi)每天都有一部分發(fā)生自身氧化解體,而且在體外溫育條件下也可產(chǎn)生氧化溶血反應(yīng)。當(dāng)紅細胞受到自由基等的攻擊時,容易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)并發(fā)生紅細胞溶血現(xiàn)象。血紅細胞發(fā)生溶血的原因可能是由于:(1)紅細胞發(fā)生過氧化反應(yīng)時,當(dāng)紅細胞內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化劑被消耗后,紅細胞膜就會發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)并引起紅細胞膜通透性和脆性的增加,膜的流動性降低、變形能力下降,最終導(dǎo)致紅細胞的形態(tài)發(fā)生腫脹、變形;(2)隨著 MDA生成量的增加,紅細胞膜蛋白發(fā)生氧化交聯(lián)或降解,紅細胞膜的骨架發(fā)生破壞,最終導(dǎo)致溶血現(xiàn)象的發(fā)生。因此,紅細胞溶血反應(yīng)的發(fā)生很可能是脂質(zhì)過氧化和紅細胞膜蛋白降解的結(jié)果。但是,內(nèi)源性抗氧化劑的消耗,脂質(zhì)過氧化,或膜蛋白質(zhì)的降解都不能清楚地解釋過氧自由基誘導(dǎo)紅細胞溶血的機制。到目前為止,有關(guān)自由基誘導(dǎo)紅細胞溶血的機制還不是完全清楚。但可以肯定的是,脂質(zhì)過氧化是紅細胞發(fā)生氧化性損傷過程中的一個主要結(jié)果,常被認為是導(dǎo)致紅細胞傷害和死亡(如溶血)的一個主要機制[16]。紅細胞是常用的分析和篩選天然抗氧化劑的實驗體系,考察對紅細胞膜結(jié)構(gòu)和功能上的影響是迄今被公認的研究細胞氧化損傷的重要方法之一。張強等[17]研究發(fā)現(xiàn)玉米抗氧化肽對 H2O2誘導(dǎo)的紅細胞氧化溶血具有較好的抑制作用 (P＜0.01),并且表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。Jesus N.S.等[18]采用人血紅細胞研究了四種亞馬遜植物多酚的抗溶血作用。

本研究探討了抗氧化肽對由大鼠紅細胞氧化性溶血的影響,結(jié)果見表 2,不同濃度的抗氧化肽對大鼠紅細胞氧化性溶血具有一定的抑制作用,即隨著抗氧化肽濃度的增加,抗氧化肽對大鼠紅細胞氧化性溶血抑制率也逐漸增加,其中在 1.25和 2.50 mg/m L濃度下的作用效果較為顯著(P＜0.05)。這表明抗氧化肽能夠抑制大鼠紅細胞氧化性溶血現(xiàn)象的發(fā)生,有效地保護紅細胞結(jié)構(gòu)的完整性。

表 2 抗氧化肽對大鼠紅細胞氧化性溶血的影響(n=3)Table 2 Effect of the antioxidant peptide on the hemolysis ofm ice RBC(n=3)

2.3 抗氧化肽 A對小鼠肝組織勻漿MDA生成的影響

機體產(chǎn)生的氧自由基能夠攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸,引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng),形成 MDA等脂質(zhì)過氧化物。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)不僅能夠把活性氧轉(zhuǎn)化成非自由基性的脂類分解產(chǎn)物,而且還能夠通過鏈式支鏈反應(yīng)放大活性氧的作用。此外,氧自由基不但能通過生物膜上多不飽和脂肪酸的過氧化反應(yīng)來損傷細胞,而且還能通過氫過氧化物分解的產(chǎn)物引起細胞損傷。由于 MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,故其含量可以用于評價脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度。張強等[17]研究發(fā)現(xiàn)玉米抗氧化肽對 Cys-Fe2+誘導(dǎo)的肝臟、心臟、腦組織脂質(zhì)過氧化也具有較好的抑制作用 (P＜0.01),表明它可以有效地減弱體外的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),但其確切的作用機制目前還少有報道。

表 3 抗氧化肽對小鼠肝組織勻漿 MDA生成的影響(n=3)Table 3 Effect of the antioxidant peptide on MDA formation ofmice liver(n=3)

嚴奉偉等[19]研究發(fā)現(xiàn)菜籽多酚能降低小鼠肝 組織勻漿的 MDA(P＜0.01),減少小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物等自由基的產(chǎn)生。在溫育條件下,肝組織勻漿在活性氧(ROS)或促氧化的金屬離子作用下,其中的不飽和脂質(zhì)會發(fā)生過氧化反應(yīng)。不同濃度的抗氧化肽在實驗濃度范圍內(nèi)對小鼠肝組織勻漿MDA形成的抑制作用如表 3所示,從表中可以看出肝組織勻漿 MDA形成的抑制率隨著抗氧化肽濃度的增加而增大,其最高抑制率可以達到 57.91%。Fe2+和 H2O2是很強的自由基誘導(dǎo)物,在體系中添加它們后,小鼠肝組織勻漿中自氧化產(chǎn)生的 MDA明顯增加?？寡趸哪軌蜉^好地抑制 H2O2誘導(dǎo)的 MDA的產(chǎn)生,而對 Fe2+誘導(dǎo)的體系則不是很明顯,具體原因還有待進一步分析。這表明抗氧化肽能夠通過清除自由基,抑制肝組織勻漿的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),穩(wěn)定肝細胞膜的結(jié)構(gòu)而對肝組織起到保護作用。

3 結(jié)論

3.1 抗氧化肽 A在一定濃度范圍內(nèi)對人肺癌細胞A549的生長具有抑制作用。

3.2 抗氧化肽 A對大鼠紅細胞氧化性溶血抑制率具有劑量依賴性,其中在 1.25和 2.50mg/m L濃度下的作用效果較為顯著(P＜0.05)。

3.3 抗氧化肽 A可以抑制小鼠肝組織勻漿 MDA的生成,抑制率隨著濃度的增加而增加,尤其對體外溫育和 H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝組織勻漿 MDA的生成具有較強的抑制作用。

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