羅 俊，劉業(yè)兵，陳 堅(jiān)，寧宜寶

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.北京信得威特科技有限公司，北京 100302；3.廣東永順生物制藥有限公司，廣東 廣州 511356)

豬流感(Swine influenza，SI)是由正粘病毒科SI病毒(SIV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病。不同日齡、性別和品種的豬均可感染該病[1-2]。目前，已發(fā)現(xiàn)的A型SIV有H1N1、H3N2、H9N2等11種血清亞型，我國(guó)流行的血清亞型主要有人源H3N2、經(jīng)典豬源H1N1和類禽源H1N1[3]。

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病。臨床上以母豬妊娠后期的繁殖障礙，新生仔豬的呼吸癥狀和仔豬的高死亡率為特征[4]。

近年來(lái)，SIV和PRRSV在臨床上多為混合感染，并且臨床癥狀不典型，僅根據(jù)臨床癥狀確診比較困難。傳統(tǒng)的鑒別診斷方法是病原分離鑒定和血清學(xué)診斷，但所需時(shí)間較長(zhǎng)，在混合感染診斷中存在不夠靈敏的情況。RT-PCR技術(shù)具有快速、敏感和易于操作的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜禽傳染病的檢測(cè)和鑒別診斷[5]。多重RT-PCR技術(shù)是在RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)，一次RT-PCR反應(yīng)能同時(shí)檢測(cè)多種病原，具有簡(jiǎn)便、快速的鑒別和檢測(cè)多種病原的優(yōu)點(diǎn)，能夠同時(shí)滿足多種疾病診斷的要求。為此，本研究進(jìn)行了SIV和PRRSV的雙重RT-PCR檢測(cè)方法的研究。

1 材料和方法

1.1 病毒株和細(xì)胞 H1N1和H3N2型SIV、禽流感(AIV)H9N2分離株、PRRSV VR-2332和BJ分離株、Marc-145細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；H5亞型AIV滅活抗原由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)由本研究所豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室提供；9日齡～10日齡SPF雞胚購(gòu)自北京中海公司。

1.2 主要試劑 TRIzol、PfuUItraTMⅡFusion HS DNA Polymerase、SuperScriptTMⅢ Reverase和 Transcriptase均購(gòu)自Invitrogen公司；pGEM-T購(gòu)自Promega公司；TOP10菌株購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)SIV亞型M基因保守序列設(shè)計(jì)SIV檢測(cè)引物，M-F：5'-TCAGGCCCCCTCAAA G-3'和 M-R： 5'-TATGAGGCCCATGCAACT-3'， 擴(kuò)增片段為345 bp。根據(jù)PRRSV美洲型毒株N基因保守序列設(shè)計(jì)PRRSV檢測(cè)引物，P-F：5'-GTGGCA GAAAAGCTGTTAAG-3'和 P-R：5'-TTGAATAGGTG ACTTAGAGGC-3'，擴(kuò)增片段為520 bp。引物由英濰捷基北京公司合成。

1.4 病毒培養(yǎng) 將PRRSV BJ株接種單層Marc-145細(xì)胞，37℃吸附1 h，加入含2%牛血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，75%細(xì)胞病變(CPE)時(shí)收毒，病毒含量為105.3TCID50/0.1 mL； H1N1亞型SIV接種9日齡～10日齡SPF雞胚尿囊腔，72 h收獲尿囊液，病毒含量為104.5EID50/0.1 mL。

1.5 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 按總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為：病毒總 RNA 10 μL，dNTP 2 μL，5×FS Buffer 4 μL，0.1 mol/L DTT 1 μL， SuperScriptTMⅢ 0.5 μL，RNase inhibiter 0.5 μL，SIV上游引物、PRRSV下游引物各1 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：42℃ 60 min，75℃15 min。

1.6 雙重RT-PCR方法的建立 反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5 μL，cDNA 2 μL，dNTP(10 mM)2 μL，Taq酶5 u，引物各1 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足至25 μL，混勻后以不同的退火溫度、延伸溫度和時(shí)間及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化。

1.7 PCR產(chǎn)物鑒定 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。檢測(cè)陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物由英濰捷基北京公司測(cè)序。

1.8 敏感性試驗(yàn) 將收獲的PRRSV BJ株病毒液用DMEM培養(yǎng)液分別稀釋為1×105TCID50/0.1 mL、1×104TCID50/0.1 mL、1×103TCID50/0.1 mL、1×102TCID50/0.1 mL和1×10 TCID50/0.1 mL進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)；將SIV H1N1分離株雞胚尿囊液用PBS分別稀釋為 1×104EID50/0.1 mL、1×103EID50/0.1 mL、1×102EID50/0.1 mL、1×10 EID50/0.1 mL和 1 EID50/0.1 mL進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。同時(shí)，相應(yīng)稀釋兩種病毒各取100 μL混合后提取RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.9 特異性試驗(yàn) 對(duì)CSFV、陰性雞胚尿囊液與PRRSV BJ株、SIV H1N1、SIV H3N2同時(shí)提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，提取PRV、PPV、PCV2 DNA，同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.10 雙重RT-PCR的應(yīng)用 將12份疑似病料分別研磨，制成混懸液，4℃3000 r/min離心10 min，取上清液。將各樣品上清液分為3份，一份用于雙重RT-PCR檢測(cè)，一份接種雞胚分離病毒，一份接種Marc-145細(xì)胞分離病毒，比較檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 雙重RT-PCR反應(yīng)的建立 對(duì)雙重RT-PCR反應(yīng)體系的退火和延伸溫度、時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定反應(yīng)條件為：94℃ 2 min；94℃ 30 s、51℃ 30 s、72℃ 1 min，35次循環(huán)；72℃ 3 min。利用引物M-F、M-R和P-F、P-R在同一個(gè)反應(yīng)體系中按上述方法擴(kuò)增出PRRSV基因組中520 bp和SIV基因組中325 bp 2個(gè)片段(圖1)。

圖1 雙重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig.1 Detection of PRRSV,SIV and AIV by duplex RT-PCR amplification

2.2 PCR產(chǎn)物的鑒定 將RT-PCR產(chǎn)物純化，連接到pGEM-T載體中測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAStar軟件與GenBank中登錄序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明擴(kuò)增的特異性片段與GenBank登錄的兩種病毒核酸序列的同源性均達(dá)98%以上。

2.3 敏感性試驗(yàn) 結(jié)果表明：SIV和PRRSV單重RT-PCR的最低有效檢測(cè)量分別為10 EID50/0.1 mL和102TCID50/0.1 mL；所建立的雙重RT-PCR檢測(cè)方法SIV和PRRSV的最低有效檢測(cè)量分別為102EID50/0.1 mL 和 103TCID50/0.1 mL(圖 2)。

2.4 特異性試驗(yàn) 對(duì)8種病毒的DNA進(jìn)行雙重PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：PRRSV BJ株、SIV H1N1、SIV H3N2擴(kuò)增得到特異性條帶，而CSFV、PRV、PPV、PCV2及陰性雞胚尿囊液均未見(jiàn)擴(kuò)增條帶，表明引物的特異性較高，適合SIV和PRRSV雙重PCR 檢測(cè)(圖 3)。

2.5 雙重RT-PCR的應(yīng)用 利用建立的雙重RT-PCR方法對(duì)臨床12份疑似病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：12份疑似病料樣品中7份為PRRSV單獨(dú)感染，2份為SIV單獨(dú)感染，3份為PRRSV和SIV混合感染。

病毒分離結(jié)果顯示：7份PRRSV單獨(dú)感染樣品和2份混合感染樣品用Marc-145細(xì)胞均分離到PRRSV，另外1份用雙重RT-PCR檢測(cè)為雙陽(yáng)性的混合感染病料樣品未分離到PRRSV，2份SIV單獨(dú)感染樣品和3份混合感染樣品用雞胚均分離到SIV，表明雙重RT-PCR檢測(cè)與病毒分離結(jié)果基本相符。

圖2 PRRSV和SIV RT-PCR敏感性試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity test of the RT-PCR assay for detection of PRRSV and SIV

3 討論

本研究利用擴(kuò)增SIV和PRRSV的特異性引物建立了雙重RT-PCR檢測(cè)方法，該雙重RT-PCR方法敏感、特異。其中，反轉(zhuǎn)錄選用特異性引物，減少了非特異性條帶的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)也曾改變引物濃度以期獲得更好的擴(kuò)增效果，但最終效果并不明顯。有試驗(yàn)表明先加入大片段引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增若干循環(huán)后，再加入小片段引物進(jìn)行多聯(lián)PCR擴(kuò)增，取得了較好的效果[6]，但該方法程序比較繁瑣。

圖3 雙重RT-PCR特異性試驗(yàn)Fig.3 Specificity test of the duplex RT-PCR amplification

對(duì)于雙重RT-PCR方法的敏感性，本研究用相同的條件分別進(jìn)行了SIV和PRRSV的單重和雙重RT-PCR敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示SIV單重和雙重RT-PCR的最低有效檢測(cè)量比Lee建立的單重RT-PCR(1 EID50/mL)和 SIV H1N1、H1N2、H3N2 多重RT-PCR檢測(cè)方法(10 EID50/mL)的最低有效檢測(cè)量低，可能是因?yàn)長(zhǎng)ee設(shè)計(jì)引物依據(jù)于不同亞型的特異片段，而本研究的引物依據(jù)于不同亞型的共同保守片段，更為重要的是Lee基于DPO(Dual priming oligonucleotide system)技術(shù)，該技術(shù)可以極大的提高PCR的敏感性與特異性[7]。本方法的PRRSV單重RT-PCR和雙重RT-PCR的最低有效檢測(cè)量分別為102TCID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL，比Hirohito建立的多重RT-PCR的最低有效檢測(cè)量(1×103TCID50/0.2 mL 和 2×103TCID50/0.2 mL)略高[6]。雖然多重RT-PCR的敏感性受到多種因素的影響，目前也無(wú)具體判定標(biāo)準(zhǔn)，但是它基于PCR技術(shù)所表現(xiàn)出的靈敏性足以滿足臨床檢測(cè)要求。

利用雙重RT-PCR對(duì)臨床12份疑似病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中1份病料樣品應(yīng)用雙重RT-PCR檢測(cè)為SIV和PRRSV混合感染，但僅分離到SIV，可能是因?yàn)椴煌腜RRSV毒株對(duì)Marc-145細(xì)胞的適應(yīng)性不同，所以出現(xiàn)該情況屬正常，表明傳統(tǒng)的病毒分離存在靈敏度低的缺點(diǎn)。

本研究建立的雙重RT-PCR方法具有敏感、特異、快速、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)病原只需4 h～5 h，為SIV和PRRSV混合感染的快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。

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