歐陽鳳菊，李兆利，赫明雷，劉慧芳，司 微，劉思國*，王春來，倪洪波，王 宇，曲娟娟*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物細(xì)菌病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001)

細(xì)菌生物被膜(Bacterial biofilm，BF)是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境，吸附于生物材料或機(jī)體腔道表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，將自身包繞而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物[1]，由此引起的相關(guān)感染性疾病及慢性感染的反復(fù)發(fā)作稱為細(xì)菌BF病，又稱菌膜病[2-3]。禽大腸桿菌(E.coli)感染是造成禽類胚胎和雛雞死亡的重要原因，可引起禽類急性敗血癥、關(guān)節(jié)炎、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎、肺炎等一系列疾病[4]。當(dāng)家禽感染禽致病性E.coli后，由于抗生藥物的不合理使用，繼而發(fā)展成為禽致病性E.coli BF病，不僅造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且作為一種常見的人獸共患病，致病性E.coli通過食物鏈侵襲攝入者同時(shí)在體內(nèi)形成生物被膜病，對人類健康同樣有著極大的威脅。

菌種類型、接入菌量、載體類型、營養(yǎng)條件和外界環(huán)境[5-7]諸多因素都影響B(tài)F的形成。觀察禽致病性E.coliBF的形成周期，了解不同條件下BF中細(xì)菌粘附載體的程度，為進(jìn)一步明確BF的形成機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對抑制禽致病性E.coliBF形成具有指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 菌種為一株野生禽致病性E.coli，由哈爾濱獸醫(yī)研究所細(xì)菌室分離鑒定保存；生物培養(yǎng)膜片、平底24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、U底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板均為Corning Costar產(chǎn)品、一次性血凝板、Maconkey培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、M63培養(yǎng)基[8]、5%TSB培養(yǎng)基[9]均為BD Falcon產(chǎn)品；結(jié)晶紫染液為Baso產(chǎn)品。

1.2 禽致病性E.coli種子液的制備 將野生禽致病性E.coli在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上活化后，挑取單菌落分別接種于LB培養(yǎng)基、5%TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)、M63培養(yǎng)基，37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)至活菌數(shù)達(dá)到約108cfu/mL，備用。

1.3 BF體外定性實(shí)驗(yàn) 利用改良的平板培養(yǎng)法[10]進(jìn)行BF定性檢測。將生物培養(yǎng)膜片分別放入每孔含有1.0 mL 5%TSB培養(yǎng)基的24孔板中，然后在各孔中加入0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木?00 μL，37℃恒溫培養(yǎng)。銀染法[11]對體外形成的BF進(jìn)行染色，用顯微鏡直接觀察到BF。

玻璃試管法按照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行檢測。在1 mL液體培養(yǎng)基的玻璃試管(12 mm×100 mm)中接種1%相應(yīng)培養(yǎng)基的禽致病性E.coli，37℃靜止培養(yǎng)后，棄培養(yǎng)液，用1.5 mL 1%結(jié)晶紫室溫下染色30 min，染色液除去，室溫干燥。肉眼觀察液面與空氣接觸處的玻璃試管壁。

1.4 BF定量檢測 采用改良后的微孔板BF檢測方法[13]。在96孔板中加入150 μL液體培養(yǎng)基，接種1%禽致病性E.coli種子液，恒溫培。培養(yǎng)結(jié)束后，用200μLPBS清洗3次，150μL甲醇固定15min。晾干培養(yǎng)板后，向每孔入150 μL 1%結(jié)晶紫染液，染色5 min，自來水沖去多余染色液，晾干；再加入150 μL 33%(v/v)冰醋酸溶液溶解結(jié)晶紫，測定OD630nm值。每次試驗(yàn)接3孔，檢測3次，取平均值。未接種的微孔OD值作為陰性對照。

OD630nm值判定標(biāo)準(zhǔn)[14]，將陰性對照平均OD值(X)加上其3倍的標(biāo)準(zhǔn)差SD定義為臨界值(cut-off值，ODc)?；谂R界值ODc，菌株BF可以分為：OD≤ODc為不粘附(-)，ODc3ODc強(qiáng)粘附(+++)。

1.5 禽致病性E.coliBF形成的影響因素

1.5.1 培養(yǎng)時(shí)間 在8 h、24 h、36 h、48 h、72 h后，按照上述方法分別對BF形成情況進(jìn)行定量和定性檢測。

1.5.2 液體培養(yǎng)基 采用3種不同的液體培養(yǎng)基，包括LB培養(yǎng)基、5%TSB培養(yǎng)基和添加Casamino Acid的M63培養(yǎng)基，按照上述方法檢測BF。

1.5.3 BF載體 采用不同的培養(yǎng)載體檢測BF。載體包括不同品牌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning Costar、Nunclon、Orange)、一次性血凝板硅膠生物培養(yǎng)膜片，玻璃試管。

1.5.4 營養(yǎng)成分 選擇營養(yǎng)成分相對較少的M63(Casamino Acid)培養(yǎng)基，添加以下營養(yǎng)成分，用優(yōu)化后的最佳條件培養(yǎng)禽致病性E.coli，按照上述方法檢測BF形成，確定不同營養(yǎng)成分對BF的影響。

在含有不同濃度的葡萄糖、蔗糖(每種糖濃度分別設(shè)為0.2%、0.5%、1%、2%、3%、5%)的M63培養(yǎng)基按1%接種量分別接種禽致病性E.coli種子液，37℃培養(yǎng)48 h后檢測。

在含不同濃度的氯化鈉(0.2%、0.5%、1%、2%、3%、5%)的M63培養(yǎng)基。

在含不同濃度的MgSO4(0.2%、0.5%、1%、2%、3%、5%)的M63培養(yǎng)基。

2 結(jié)果

2.1 定性檢測不同條件對BF的影響 顯微鏡觀察BF的形成結(jié)果表明：試驗(yàn)菌株BF在8 h處于細(xì)菌起始粘附過程，可觀察到少量細(xì)菌開始粘附于載體上；24 h細(xì)菌開始大量的粘附，有若干微菌落形成；至48 h已經(jīng)形成成熟完整BF，大量微菌落連成片狀；72 h后微菌落減少，BF開始脫落，新的一輪BF開始形成(圖1)。

利用玻璃試管法直觀在試管壁上觀察BF：接種后24 h大量細(xì)菌開始粘附于試管壁，至48 h時(shí)形成完整的BF，72 h后細(xì)菌開始脫落；但在營養(yǎng)匱乏的M63培養(yǎng)基中，雖然接種后8 h就有細(xì)菌粘附，36 h BF生長狀態(tài)最佳，但與LB中的BF比較，膜薄且膜內(nèi)細(xì)菌粘附性差。在5%TSB培養(yǎng)基上，在接種后36 h細(xì)菌開始粘附，48 h時(shí)被膜最厚(圖2)。

圖1 5%TSB培養(yǎng)基、硅膠生物培養(yǎng)膜片上不同培養(yǎng)時(shí)間形成BF（銀染法×100）Fig.1 The biofilm devolpment at 37℃ in 5%TSB medium on the Bio-cultural material at different time point by silver staining(×100)

圖2 3種培養(yǎng)基中玻璃試管上不同培養(yǎng)時(shí)間所形成的BFFig.2 The biofilm devolped at different times post inoculation in different mediums

2.2 定量檢測不同條件對BF的影響 通過OD630nm值檢測BF的強(qiáng)弱程度，結(jié)果顯示當(dāng)血凝板作為載體時(shí)，在LB和M63培養(yǎng)基上，試驗(yàn)菌株在24 h時(shí)OD值達(dá)到最大值而后逐漸降低，此時(shí)BF粘附性最強(qiáng)(++)；但在5%TSB培養(yǎng)基上，72 h時(shí)OD值顯示仍為弱粘附狀態(tài)(+)，該培養(yǎng)條件不利于試驗(yàn)菌BF的形成；采用不同品牌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板作為載體時(shí)，用5%TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，試驗(yàn)菌在Costar(OD630nm=0.246)和 Orange(OD630nm=0.265)兩 種96孔板均能產(chǎn)生強(qiáng)BF(+++)，見圖3。

2.3 定量檢測不同營養(yǎng)成分對BF的影響 在營養(yǎng)成分較單一的M63中添加糖類物質(zhì)，BF的OD值明顯升高。培養(yǎng)基中添加葡萄糖容易被細(xì)菌利用，大量細(xì)菌粘附于載體上，形成了強(qiáng)BF；葡萄糖濃度越高(<3%)，被膜粘附性越強(qiáng)。培養(yǎng)基中添加蔗糖，細(xì)菌粘附狀態(tài)由弱轉(zhuǎn)變成中等粘附；蔗糖濃度>1%，OD值不再明顯提高。添加低濃度的NaCl可以促進(jìn)該菌BF的形成；高濃度的NaCl抑制細(xì)菌的生長甚至殺死細(xì)菌，從而完全抑制BF的形成。添加終濃度為1%MgSO4時(shí)，OD值升高，Mg2+能夠促進(jìn)BF的形成(圖 4)。

3 討論

圖3 不同培養(yǎng)基、不同載體、不同培養(yǎng)時(shí)間對BF的影響Fig.3 Effects of different temperatures,mediums and adherent materials onE.colibiofilm development

圖4 不同營養(yǎng)成分對BF的影響(OD630nm)Fig.4 Effects of glucose,sucrose,sodium chloride,and sodium sulfate concentration on biofilm development of E.coli

本實(shí)驗(yàn)采用BF體外定性實(shí)驗(yàn)和定量粘附性實(shí)驗(yàn)對一株野生禽致病性E.coli生被膜的生長情況進(jìn)行了72 h的連續(xù)觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地展示了禽致病性E.coliBF形成周期的5個(gè)階段：起始附著階段、粘附階段、形成早期的BF、形成成熟的BF、老化散播階段。其形成周期與銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、禽沙門氏菌等細(xì)菌BF的形成周期[15]是一致的。BF形成過程是比較復(fù)雜的。首先是細(xì)菌黏附于附著物表面，之后即開始生長，在這一過程中將分泌大量胞外多聚物(Extracellular polymeric substances，EPS)形成微菌落使BF結(jié)構(gòu)加厚[16]。成熟的BF結(jié)構(gòu)是不均質(zhì)的，在大量的微菌落之間還分布有運(yùn)送養(yǎng)料和代謝產(chǎn)物以及排出廢物的通道。最后，浮游菌從成熟的膜內(nèi)釋放，在新的部位形成新的菌落。因此，控制BF的形成一般要在其形成的初期給予抗生素藥物抑制細(xì)菌的生長。確定禽E.coliBF形成周期對于臨床治療禽E.coli疾病是十分重要的。

本研究中體外定性實(shí)驗(yàn)是通過平板培養(yǎng)法和玻璃試管法完成的。相同培養(yǎng)基時(shí)，生物培養(yǎng)膜片(硅膠)和玻璃試管上的BF生長周期幾乎是一致的。即5%TSB培養(yǎng)基中的完整的BF均是在48 h時(shí)形成的；平板培養(yǎng)法從微觀角度更好地體現(xiàn)了從起始到形成完整BF細(xì)菌粘附的過程。不同培養(yǎng)基玻璃試管為載體時(shí)，M63培養(yǎng)基8 h時(shí)已經(jīng)有明顯的細(xì)菌粘附且在36 h就出現(xiàn)了完整的BF，隨后72 h BF變薄。這一過程與其他培養(yǎng)基中BF形成階段有差別，可能由于M63培養(yǎng)基營養(yǎng)成分較少，隨著營養(yǎng)物質(zhì)消耗、代謝廢物的聚集使浮游細(xì)菌提前進(jìn)入一種饑餓狀態(tài)(類芽孢狀態(tài))[17]，處于類芽孢生長狀態(tài)的細(xì)菌粘附于玻璃試管壁形成被膜，此時(shí)的細(xì)菌像芽孢一樣對物理和化學(xué)消毒劑有強(qiáng)大的抵抗力。

依據(jù)遺傳學(xué)研究和多聚糖分析的證實(shí)：在E.coli和表皮葡萄球菌等多種細(xì)菌中，BF的完整性依賴于β-1，6-N-乙酰-D-葡萄糖胺的多聚化[18]。我們發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)成分相對較少的M63培養(yǎng)基，添加葡萄糖、蔗糖、低濃度鹽和Mg2+對禽致病性E.coli BF形成有一定的促進(jìn)作用。糖類作為碳源營養(yǎng)物質(zhì)不但有利于細(xì)菌生長繁殖，同時(shí)也是糖代謝的主要物質(zhì)來源，促使細(xì)菌產(chǎn)生大量多糖復(fù)合物使微菌落大量粘連，形成更強(qiáng)的BF。有研究認(rèn)為鈉、鎂等陽性金屬離子是常常作為帶負(fù)電的細(xì)菌和帶負(fù)電的物體表面(自然界多數(shù)表面都帶負(fù)電)連接的橋梁。但MartnsiL等認(rèn)為Mn2+，Mg2+等金屬離子影響合成酶的活性，這些合成酶是用來調(diào)控藻酸鹽的合成[14]。

BF作為自然界中細(xì)菌主要的生存方式，給人類的生產(chǎn)生活帶來了嚴(yán)重危害。建立禽致病性E.coli BF的體外模型，為進(jìn)一步探討細(xì)菌粘附和細(xì)菌BF的形成機(jī)理、阻斷細(xì)菌BF的形成提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Corona-Izquierd o P F,Jogre M H.Biofilm for mation inEseherichia coliaffected by 3-(N-morPholino)propane sulfonate(MOPS)[J].Res Microbiol,2002,153:181-185.

[2]田德英，倪明，余冰，等.新型mucA基因突變的銅綠假單胞菌生物被膜的形成和藻酸鹽相關(guān)基因表達(dá)的研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2006，26(1)：14-17.

[3]屈常林，高洪.細(xì)菌生物被膜與抗生素耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29(3)：86-89.

[4]高裕，劉秀梵，張如寬，等.我國部分地區(qū)禽病原性大腸桿菌的分離與鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，30(2)：164-171.

[5]Sillankorva S,Neubauer P,Azeredo J.Pseudomonas fluorescensbiofilms subjected to phage phiIBB-PF7A [J].BMC Biotechnol,2008,8(1):79-81.

[6]Piao Z,Sze C C,Barysheva O,et al.Temperature-regulated for mation of mycelial mat-like biofilms byLegionellapneumophila[J].Appl Environ Microbiol,2006,72(2):1613-1622.

[7]Esteban J,Martin-de-Hijas N Z,Kinnari T J,et al.Biofilm developmentby potentially pathogenic non-pigmented rapidly growing mycobacteria[J].BMC Microbiol,2008,8(1):184-189.

[8]Sturgill G,Toutain C M,Komperda J,et al.Role of CysEin production of an extracellular signaling molecule inProvidencia stuartiiand Escherichia coli:loss of cysEenhances biofilm for mation in Escherichia coli[J].Bacteriol,2004,186:7610-7617.

[9]Skyberg J A,Siek K E,Doetkott C,et al.Biofilm for mation by avian Escherichia coliin relation to media,source and phylogeny[J].J Appl Microbiol,2006,1364-5072.

[10]Ishida H,Ishida Y,Kurosaka Y,et al.In vitroandin vivoactivities of levofloxacin againstbiofilm-producing pseudomonas aeruginosa[J].Antimicrob Agents Chemother,1998,42(7):1641-1645.

[11]何平，李乃靜，李勝岐.銀染法鑒定克雷伯桿菌生物被膜[J].中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2002，22(2)：84-85.

[12]Kaplan B J,Mulk H M.Biofilm for mation is prevalent among field isolates of Actinobacillus pleuropneumoniae[J].Vet Microbiol,2005,108:89-94.

[13]Srdjan S,Dragana V,Ivana D,et al.A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcalbiofilm for mation[J].Microbiol Meth,2000,40:175-179.

[14]Stepanovic S,Cirkovic I,Ranin L,et al.Biofilm for mation by Salmonella spp.and Listeria monocytogeneson plastic surface[J].Lett Appl Microbiol,2004,38:428-432.

[15]丁麗莎，王瑤.鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性與細(xì)菌生物膜的相互關(guān)系[J].微生物學(xué)報(bào)，2009，49(4)：417-422.

[16]Donlan R M.Biofilms:Microbial life on surfaces[J].Emerg Infect Dis,2002,8:881-890.

[17]賈鳴，胡曉梅，胡福泉，等.細(xì)菌生物被膜的耐藥機(jī)制及控制策略[J].生命的化學(xué)，2008，28(3)：315-317.

[18]Itoh Y,Wang X,Hinnebusch B J,et al.Depolymerization of β-1,6-N-Acetyl-D-Glucosamine disrupts the integrity of diverse bacterial biofilms[J].J Bacteriol,2005,187:382-387.