張莉莉，白 娟，王先煒，李玉峰，王興龍，姜 平

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室，江蘇南京210095)

近來研究表明，機體針對病毒及其他病原生物等病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的入侵所產(chǎn)生的先天性免疫及特異性免疫由模式識別受體啟動。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)是1997年發(fā)現(xiàn)的一類重要的模式識別受體[1]，迄今共發(fā)現(xiàn)11種人的TLR和13種小鼠TLR[2]。每種TLR家族能識別特異的微生物病原體PAMP，并觸發(fā)激活特殊的信號途徑，導(dǎo)致炎性和抗炎性細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄翻譯[3]。其中，TLR3、7、8都屬于識別核酸的TLR家族成員，TLR3識別病毒來源的雙鏈RNA及人工合成的雙鏈RNA-Poly-IC[4]，TLR7、8具有很高的相似程度，它們均參與單鏈RNA病毒的識別[5]。巨噬細胞(AM)、中性粒細胞、樹突狀細胞(DC)等多種免疫細胞均可高水平表達多種TLR[6]。因此，研究豬TLR3、7、8基因的結(jié)構(gòu)和功能對于揭示豬傳染病的發(fā)生和傳播機制及天然免疫的調(diào)節(jié)機理具有重要的意義。

目前，國外對于豬TLR3、7、8分子的研究已取得一定進展，Liu等發(fā)現(xiàn)用豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)感染豬后，TLR2、3、4、7、8的表達量在至少一種淋巴細胞或組織中有上調(diào)[7]，Poly IC刺激后能下調(diào)AM和DC的TLR7和TLR8的表達。而國內(nèi)對豬TLR3、7、8的研究尚未見報導(dǎo)。本實驗從豬肺泡巨噬細胞(PAM)中克隆豬TLR3、7、8基因，并用生物信息學(xué)方法進行分析，旨在為深入研究豬TLR3、7、8的分子功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品及主要試劑 DH5α由本實驗室保存；PAM由PRRSV陰性豬肺臟分離；Trizol試劑購自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；Taq酶購自Tiangen公司；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、pMD18-T載體購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 PAM的分離與培養(yǎng) 選4周齡～6周齡健康仔豬，無菌摘取豬肺臟，用含0.2%的EDTA的PBS灌洗肺臟。灌洗液經(jīng)8層紗布過濾后1500 r/min離心15 min，用0.01 M PBS(pH7.0)洗滌2次，最后用含10%新生牛犢血清的RPMI-1640營養(yǎng)液重懸，經(jīng)0.2%臺盼蘭檢測細胞活性達90%以上，調(diào)整細胞濃度為5×105/mL，鋪于細胞板，37℃培養(yǎng)4 h～6 h后棄去未貼壁細胞，37℃5%CO2培養(yǎng)。

1.3 RNA提取 取出六孔板中PAM細胞培養(yǎng)物，采用TRIzol試劑裂解法提取細胞總RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計及RT-PCR擴增 根據(jù)GenBank中登錄的TLR3、7、8的序列，應(yīng)用軟件Primer 5.0進行引物設(shè)計，由Invitrogen公司合成(表1)。以O(shè)ligo dT和不同基因的下游引物進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：94℃3 min；94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.5 目的基因克隆和測序 PCR產(chǎn)物回收純化，按常規(guī)方法與pMD18-T載體進行連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)菌體。挑取單個菌落，于LB培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定出陽性克隆，由上海英駿公司進行測序。

表1 RT-PCR引物Table 1 Primers used in RT-PCR

1.6 序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測 將基因測序結(jié)果與GenBank中登錄的相關(guān)序列進行BLAST比較，用DNAStar軟件分析其遺傳演化關(guān)系，運用TMHMM Server v2.0軟件分析其跨膜區(qū)。

2 結(jié)果與討論

2.1 TLR不同基因片段RT-PCR擴增結(jié)果 PCR擴增得到TLR3、7、8的8條基因片段，與預(yù)期的大小結(jié)果相符(圖1)。由于TLR3、7、8基因較長，采用RT-PCR一次擴增獲取全長基因難度較大，所以本研究采用分片段擴增方法，獲得較好效果。本實驗中，分別用Oligo dT和下游引物進行反轉(zhuǎn)錄，結(jié)果顯示下游引物反轉(zhuǎn)錄的效果更好。

2.2 TLR基因克隆與酶切鑒定 將TLR基因不同片段重組質(zhì)粒pMD-TLR3、pMD-TLR7和pMD-TLR8，進行雙酶切鑒定。得到的外源片段的大小與PCR擴增得到的相對應(yīng)的TLR的基因大小一致，證明目的基因已成功克隆至T載體中。

2.3 TLR基因測序結(jié)果 將不同基因的分片段擴增的結(jié)果拼接，獲得豬TLR3、7、8全基因序列，并已錄入 GenBank，序列號分別為 GU013759、GU013760和GU013761。其中，pTLR3、7、8基因開放閱讀框(ORF)分別為2718 bp，3153 bp，3087 bp，分別編碼906個、1051個、1029個氨基酸。

2.4 TLR基因遺傳演化分析 將克隆豬TLR3、7、8的序列用DNAStar軟件分別與豬、人、鼠、牛、羊、馬、雞相應(yīng)基因序列進行同源性分析。結(jié)果顯示，TLR3基因序列與其他豬的序列同源性達99.3%～99.8%，與牛、馬、人、鼠的同源性分別為88.6%、89.4%、86.0%和80.1%(圖2A)。TLR7基因序列與其他豬的同源性達98.9%～99.8%，不同種之間與牛的同源性較高達90.1%，與羊、人、鼠的同源性分別為89.1%、87.3%、80.7%，與雞的同源性最低僅為66.6%(圖2B)。TLR8基因序列與其他豬的同源性達99.3%～99.5%，與牛、羊、人、鼠的同源性分別為84.2%、83.3%、79.8%、74.3%(圖2C)。其基因系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果表明，各種動物TLR基因系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系上與物種之間的親緣關(guān)系密切。

2.5 豬TLR3、7、8基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分析 豬TLR3基因，種內(nèi)比較同源性很高，僅在aa 87、aa 281、aa 369、aa 419和aa 701共5處存在突變，與牛、羊、馬、人、鼠相比差異較大，共有保守區(qū)為 aa 36～aa 44、aa 53～aa 63、aa 153～aa 167、aa 170～aa 179、aa 511～aa 523、aa 645～aa 655、aa 727～aa 741、aa 830～aa 850、aa 856～aa 874、aa 876～aa 887，末端同源性較高。

不同豬的TLR7基因氨基酸序列非常保守，在aa 79、aa 389和aa 963有3處突變，與牛、羊、雞、人、鼠相比，保守區(qū)在aa 41～aa 88、aa 80～aa 89、aa 164～aa 173、aa 189～aa 201、aa 266～aa 278、aa 307～aa 315、aa 940、aa 954、aa 957～aa 968。

豬TLR8基因氨基酸序列，種內(nèi)在aa 609、aa 780、aa 850、aa 867、aa 870、aa 892、aa 918、aa 928和aa 935存在9處突變，與牛、羊、人、鼠相比保守區(qū)在 aa 130～aa 139、aa 252～aa 261、aa 292～aa 301、aa 614、aa 623、aa 877～aa 885、aa 946～aa 954、aa 956～aa 970、aa 989～aa 1006，末端同源性較高。

2.6 跨膜區(qū)預(yù)測 運用TMHMM Server v2.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，豬TLR3基因編碼的分子可能由胞外區(qū)(aa 1～aa 703)、跨膜區(qū)(aa 704～aa 726)和胞內(nèi)區(qū)(aa 727～aa 905)3部分組成。

豬TLR7、8基因編碼分子可能的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)分別位于aa 1～aa 843和aa 1～aa 814、aa 844～aa 866和 aa 815～aa 837以及 aa 867～aa 1050和 aa 838～aa 1028。因此，豬 TLR3、TLR7、TLR8蛋白均是跨膜蛋白，這與目前已知的TLR家族所共有的結(jié)構(gòu)相一致。

TLR在病毒感染和宿主免疫中的作用已受到人們的廣泛關(guān)注。TLR分子和功能的鑒定，不僅使人們對天然免疫系統(tǒng)地認識達到一個新的水平，而且也為傳染性疾病的治療提供了新的思路，如Nicol等的研究表明HIV可以通過對Toll樣受體免疫應(yīng)答途徑的抑制來降低TNF-α的合成量，從而抑制機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)[9]。TLR3對流感病毒引起的肺炎具有一定的抑制作用[10]。目前，人和鼠的TLR研究取得了較大的進展，但有關(guān)豬、牛和家禽等動物TLR分子結(jié)構(gòu)與功能的研究甚少，特別是在宿主動物識別病原模式、病原與宿主相互作用的機制研究等方面尚未引起廣泛關(guān)注。本研究從分離的豬肺泡巨噬細胞中，克隆了豬TLR3、7、8基因，為其結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]Aderem A,Ulevitch R J.Toll-like receptors in the induction of the innate immune response[J].Nature,2000,406:782-786.

[2]Takeda K,Kaisho T,Akira S.Toll-like receptors[J].Annu Rev Immuno1,2003,21:335-376.

[3]Krishnan J,Selvarajoo K,Tsuchiya M,et al.Toll-like receptor signal transduction[J].Exp Mol Med,2007,39:421-438.

[4]Diebold S S,Kaisho T,Hemmi H,et al.Innate antiviral responsesby meansofTLR7-mediated recognition ofsingle-stranded RNA[J].Science,2004,303(5663):1529-1531.

[5]Tarr A W,Owsianka A M,Timms J M,et al.Characterization of the hepatitis C virus E2 epitope defined by the broadly neutralizing monoclonal antibody AP33[J].Hepatology,2006,43(3):592-601.

[6]Shizuo A,Satoshi U,Osamu T.Pathogen recognition and innate immunity[J].Cell,2006,124:783-801.

[7]Liu C H,Chaung H C,Chang H I,et al.Expression of Toll-like receptor mRNA and cytokines in pigs infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Vet Microbiol,2009,136:266-276.

[8]Chaung H C,Chen C W,Hsieh B L,et al.Toll-like receptor expressions in porcine alveolar macrophages and dendritic cells in responding to poly IC stimulation and porcine reproductive and respiratory sybdrome virus(PRRSV)infection[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2008,in press.

[9]Nicol M Q,Mathys J M,Pereira A,et al.Human immunodeficiency virus infection alters tumor necrosis factor a production via Toll-like receptor-dependent pathways in alveolar macrophages and U1 cells[J].J Virol,2008,82(16):7790-7798.

[10]Le Goffic R,Balloy V,Lagranderie M,et al.Detrimental contribution of the Toll-like receptor(TLR)3 to influenza A virus-induced acute pneumonia[J].PLoS Pathog,2006,2(6):53.