遲 源，王 好*，錢愛東

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118)

羊傳染性膿皰病(Contagious ecthyma)是由羊傳染性膿皰病毒(Orf virus)引起的一種人畜共患、接觸性、嗜上皮性傳染病，俗稱羊口瘡(Orf)。近些年來該病呈現(xiàn)重新流行的趨勢，世界各地都相繼報道了該病的流行[1-3]。范春玲等報道了我國2006年北京市亞福動物養(yǎng)殖中心暴發(fā)該病，傳播速度快，發(fā)病率高達95.4%[4]。Orf病毒的開放閱讀框ORF059基因即F1L基因，與痘苗病毒的H3L基因具有一定的同源性[5]，其編碼的39 ku蛋白是囊膜蛋白[6]，與病毒吸附和穿入宿主細胞有關(guān)，是刺激宿主免疫應(yīng)答的主要抗原之一[7]，ORF027基因表達病毒核蛋白。因此，本實驗對采自吉林省榆樹市的疑似本病的羊痂皮病料進行了病毒分離鑒定，并對該分離株的ORF027基因、ORF059部分基因進行克隆、序列分析以及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，旨在為研究本病的流行規(guī)律和新型疫苗研制奠定其生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病料來源 吉林省榆樹市2007年自然感染、臨床疑似Orf的病羊，無菌采集其口唇部痂塊組織。

1.2 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶、E.coliDH5α及pMD18-T載體均購自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自杭州維特潔生化技術(shù)有限公司。

1.3 病毒分離

1.3.1 病料處理 無菌采集的痂塊稱重、研磨，按1∶5(W/V)比例加入 PBS制成懸液，加入雙抗2000IU/mL，置4℃過夜，離心取上清液，-20℃保存。

1.3.2 病毒的分離培養(yǎng) 無菌摘取新生健康犢牛睪丸，以0.25%胰蛋白酶37℃消化制備單個細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)。挑選生長致密單層細胞消化制成懸液，加入處理的病毒液0.5 mL及5%血清濃度的MEM營養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)，另設(shè)空白細胞作對照，當(dāng)出現(xiàn)75%的細胞病變(CPE)時收毒。

1.4 分離病毒的鑒定

1.4.1 形態(tài)觀察 將反復(fù)凍融2次的病毒細胞培養(yǎng)物離心，取沉淀物用20 g/L的磷鎢酸作常規(guī)負染，置透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.2 PCR引物的設(shè)計 參照GenBank中登錄的Orf病毒的ORF027、ORF059基因序列，設(shè)計了2對引物。P1：5'-GGCGATGG AGGCGATTA-3'，P2：5'-TCGACCCCGCGAAGGT-3'， P3： 5'-GCGGTGGA ATGGAAAGA-3'， P4： 5'-AGCAGGTATGCCAGGA TG-3'。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4.3 PCR擴增 病毒基因組提取：將出現(xiàn)病變的細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融2次，加入SDS和蛋白酶K至終濃度分別為5 mL/L和200 μg/mL消化，以Tris平衡酚溶液、氯仿-異戊醇(24∶1)溶液抽提細胞基因組DNA，溶于TE緩沖液中。

PCR反應(yīng)的總體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL ； dNTPs(各 2.5mmol/μL)2.0 μL ； ExTaq DNA 聚合酶 (5 u/μL)0.25 μL；P1(20 pmol/μL)0.5 μL；P2(20 pmol/μL)0.5 μL；模板 DNA 1.0 μL；滅菌去離子水18.25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃5 min，94℃45 s，51.6℃ (ORF027)或 48.2℃ (ORF059)40 s，72℃40 s，30個循環(huán)，72℃10 min。擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.4 目的基因的克隆與測序 采用DNA凝膠回收試劑盒對回收的目的DNA進行純化，純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上篩選單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。提取重組質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、PCR方法鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒進行序列測定。

1.4.5 序列比較分析及進化樹繪制 利用DNAStar軟件將測定結(jié)果與國內(nèi)外具有代表性的參考毒株進行序列同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒分離 細胞接種病毒48 h后，開始有少量的細胞聚集、懸浮，72 h時在局部出現(xiàn)貼壁細胞變圓，腫脹，病變部位上方可見脫落的細胞團。隨著時間延長，病變部位擴大，出現(xiàn)大片網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，第6 d CPE達到70%時收毒；而對照細胞生長正常。病毒培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的CPE與詹述宣等描述的特征基本一致[8]。該病毒產(chǎn)生CPE的相關(guān)報道中CPE出現(xiàn)及產(chǎn)生的時間差異很大，從幾個小時到2 d。本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著分離株較快地適應(yīng)犢牛睪丸細胞，并且傳代次數(shù)增加，其CPE更加規(guī)律。這表明在一定代數(shù)內(nèi)，隨著傳代次數(shù)的增多，分離株對犢牛睪丸細胞的適應(yīng)性增強。

2.2 電鏡結(jié)果 電鏡下觀察到了典型的Orf病毒粒子，大小約為200 nm，病毒表面有特征性的管狀結(jié)構(gòu)，這些管狀結(jié)構(gòu)斜向平行地從病毒粒子的長軸從上向下由左至右盤旋(圖1)，與文獻描述相符[9]。將該Orf病毒分離株命名為Orf-ys。

2.3 病毒基因克隆及鑒定 將病毒基因組的PCR擴增產(chǎn)物克隆于pMD18-T載體中，通過瓊脂糖凝膠電泳及PCR鑒定，均得到一致結(jié)果。鑒定正確的重組質(zhì)粒進行測序，結(jié)果證實插入的DNA片段大小為446 bp、704 bp，與預(yù)期設(shè)計完全一致。

2.4 序列比較及分析 利用DNAStar軟件將測序結(jié)果與Genbank中登錄的Orf病毒不同毒株進行序列比較分析。結(jié)果表明，ORF027基因與參考毒株的核苷酸序列同源性為97.6%～98.6%，同源性最高的為美國OV-IA82株，證明該基因較為保守；氨基酸序列分析表明，分離株有3個氨基酸位點發(fā)生突變：分別為第53位E變成G，第79位E變成D，第128位D變成E。這些氨基酸間的差異是否影響其病毒的毒力或分型則有待于深入研究。ORF059基因與參考毒株的核苷酸序列同源性為96.9%～98.4%，與Orf病毒OV/C2株同源性最高。核苷酸序列未發(fā)生較大改變，表明不同毒株的這段基因相對比較保守，變異率較低。

2.5 遺傳進化關(guān)系 將所測定的Orf-ys分離株的兩段基因與國內(nèi)外發(fā)表的毒株相應(yīng)片段作序列比較，應(yīng)用軟件所計算的遺傳距離繪制系統(tǒng)進化樹(圖2與圖3)，ORF027基因進化樹結(jié)果顯示，Orf-ys分離株形成獨立的進化分支，并與美國OV-IA82株親緣關(guān)系較近。ORF059基因進化樹結(jié)果顯示，Orf-ys分離株與意大利OV/C2、OV/mi-90株親緣關(guān)系較近。

本研究利用犢牛睪丸細胞從自然發(fā)病羊的痂皮材料中成功地分離了1株Orf病毒，并根據(jù)其核酸序列分析了該分離株與其它參考病毒株的差異、分析其基因的遺傳起源，為本病流行規(guī)律的探索和新型疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。

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