呂敏娜，覃宗華，余勁術(shù)，袁建豐，孫銘飛，吳彩艷，蔡建平

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640)

埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)是一種血清型多樣、能感染各種動(dòng)物和人類并引起嚴(yán)重疾病的革蘭氏陰性菌。由于抗生素的濫用/誤用，導(dǎo)致E.coli耐藥性菌株不斷出現(xiàn)，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)動(dòng)物和人類的健康都造成了危害，因此，免疫預(yù)防已成為防治E.coli病的首選方法。

細(xì)菌菌蛻(Bacterial ghost)是指缺乏細(xì)胞漿和核酸的無(wú)活力細(xì)菌菌(殼)體[1-2]，是在噬菌體phiX174的裂解基因E所表達(dá)的裂解蛋白作用下，在G-細(xì)菌細(xì)胞膜上形成直徑約40 nm～200 nm的特異性跨膜孔道，在滲透壓差的作用下，細(xì)菌的胞質(zhì)內(nèi)容物由孔道流出[3-4]，從而產(chǎn)生的細(xì)菌空殼。菌蛻完好地保留了菌體表面的各種抗原結(jié)構(gòu)和粘附活性，可以類似活菌體誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)反應(yīng)[5-6]。菌蛻技術(shù)被認(rèn)為是研究開(kāi)發(fā)新型基因工程疫苗的技術(shù)平臺(tái)[7-8]。本研究通過(guò)構(gòu)建鴨源E.coliO78/pHH43菌蛻及其免疫原性的試驗(yàn)研究，為進(jìn)一步研制非變性滅活基因工程菌蛻疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料 含有E基因的裂解重組質(zhì)粒pHH43為本研究室保存；鴨源E.coliO78為本課題組從廣東省珠三角地區(qū)某發(fā)病鴨場(chǎng)分離、鑒定并保存的菌珠；慶大霉素、氯霉素均購(gòu)自上海生工生物工程服務(wù)有限公司；實(shí)驗(yàn)雛鴨購(gòu)自廣州市郊某養(yǎng)鴨場(chǎng)。

1.2 E.coliO78/pHH43菌蛻的制備

1.2.1 質(zhì)粒pHH43轉(zhuǎn)化E.coliO78將pHH43轉(zhuǎn)化氯化鈣法制備的感受態(tài)E.coliO78后，以含氯霉素(34 μg/mL，以下同)的LB瓊脂平板進(jìn)行篩選，挑取單菌落于含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌命名為E.coliO78/pHH43。

1.2.2 E.coliO78/pHH43菌蛻的制備 E.coli O78/pHH43接種含氯霉素的LB平板上，28℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單菌落于3 mL含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃200 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日取1 mL轉(zhuǎn)接于30 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃200 r/min培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.5時(shí)，升溫至42℃，誘導(dǎo)4 h。其間每隔1 h取樣，測(cè)定OD600nm及活菌數(shù)，觀察其誘導(dǎo)結(jié)果。

1.2.3 裂解效率觀察 將誘導(dǎo)后E.coliO78/pHH43菌蛻做如下處理：一是直接凍干；二是以PBS洗滌3次，5000 r/min，10 min，定容到原體積后進(jìn)行凍干。凍干后用同體積的LB液體培養(yǎng)基重懸，各取凍干前、后的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，按失活率=(1-凍干后活菌數(shù)/凍干前活菌數(shù))×100%計(jì)算失活率。

凍干后重懸的E.coliO78/pHH43菌液分別添加不同濃度的慶大霉素(62 μg/mL～150 μg/mL)，室溫作用1 h后，分別涂布LB平板(含上述濃度氯霉素，100 μL/板)，37℃恒溫箱培養(yǎng)16 h，確定使未裂解存活菌完全失活的慶大霉素濃度。

1.3 鴨源E.coli菌蛻的免疫原性研究

1.3.1 抗原的制備 E.coliO78/pHH43菌蛻的制備：將誘導(dǎo)4 h的E.coliO78/pHH43菌液用PBS洗滌3次，凍干后重懸，添加慶大霉素(124 μg/mL)，經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格，即為E.coliO78/pHH43菌蛻，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

E.coliO78福爾馬林滅活菌苗：E.coliO78菌液加入福爾馬林滅活，經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格后，加入蜂膠佐劑(10 mg/mL)，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和免疫方法 試驗(yàn)組1：E.coliO78/pHH43菌蛻以不同劑量4×109cfu/只、6×109cfu/只、8×109cfu/只、1×1010cfu/只和 1.2×1010cfu/只分別接種7日齡雛鴨，30只/組，觀察免疫保護(hù)效果。

試驗(yàn)組2：E.coliO78/pHH43菌蛻與E.coliO78傳統(tǒng)滅活苗均以8×109cfu/只劑量免疫7日齡雛鴨，30只/組，比較保護(hù)效果。

以上兩組均于免疫后14 d，E.coliO78腿部肌肉注射攻毒(2×108cfu/只)，觀察臨床反應(yīng)，并于攻毒后7 d迫殺存活鴨，剖檢觀察病變。按免疫保護(hù)(RPS)=(1-免疫組死亡數(shù)/對(duì)照組死亡數(shù))×100%公式計(jì)算免疫保護(hù)率。

2 結(jié)果

2.1 E.coliO78/pHH43菌蛻的制備 E.coliO78/pHH43在28℃，200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.5時(shí)，立刻升溫至42℃進(jìn)行誘導(dǎo)，隨誘導(dǎo)時(shí)間OD600nm值不斷上升，但其活菌數(shù)卻下降，裂解百分率升高，誘導(dǎo)4 h后基本處于平穩(wěn)狀態(tài)(圖1)。

經(jīng)直接凍干及洗滌3次后進(jìn)行凍干處理，分別取凍干前及凍干后重懸的菌液作稀釋，各取100 μL涂平板計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，凍干并不能使活菌100%失活(表1)。因此，需要進(jìn)一步添加慶大霉素使其完全滅活。結(jié)果表明慶大霉素的終濃度為124 μg/mL時(shí)能夠使未裂解的存活菌100%滅活。

2.2 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 第一組E.coli O78/pHH43菌蛻免疫組以1×1010cfu/只免疫7日齡雛鴨可獲得100%的免疫保護(hù)，以8×109cfu/只免疫劑量獲得87.5%的免疫保護(hù)(表2)。第二組E.coli O78/pHH43菌蛻與E.coli O78傳統(tǒng)滅活苗組攻毒后結(jié)果表明：E.coli O78/pHH43菌蛻與E.coli O78傳統(tǒng)滅活苗對(duì)雛鴨均有免疫保護(hù)效果，但E.coli O78/pHH43菌蛻免疫保護(hù)率為87.5%，稍高于傳統(tǒng)的甲醛滅活菌苗的免疫保護(hù)率 75%(表 3)。

表1 E.coliO78/pHH43菌蛻凍干結(jié)果Table 1 Inactivating effect ofE.coliO78/pHH43 bacterial ghost by lyophilized method

表2 E.coliO78/pHH43菌蛻不同免疫劑量的免疫保護(hù)效果Table 2 E.coliO78/pHH43 bacterial ghost of different doses of immune protective effect

3 討論

編碼phiX174噬菌體E裂解基因的重組質(zhì)?？稍跍孛糇瓒粼1857的控制下進(jìn)行E基因的限制性表達(dá)，在溫度低于30℃時(shí)，阻遏蛋白c1857的表達(dá)可使E基因的表達(dá)得以很好抑制；而當(dāng)溫度高于30℃時(shí)，阻遏蛋白c1857發(fā)生熱失活，解除對(duì)E基因表達(dá)的抑制導(dǎo)致發(fā)生菌體的裂解作用，并且在42℃達(dá)到最大的裂解效應(yīng)。利用這一原理，本實(shí)驗(yàn)以雛鴨為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以鴨源致病性E.coliO78為試驗(yàn)菌，將帶有E裂解基因的重組質(zhì)粒pHH43轉(zhuǎn)化至此宿主菌，并經(jīng)熱誘導(dǎo)方法制備了E.coli菌蛻。

表3 E.coli菌蛻與傳統(tǒng)滅活疫苗的免疫保護(hù)效果比較Table 3 Comparison of protective effect betweenE.coli bacterial ghost and traditional inactivated of vaccine

含有E基因的裂解質(zhì)粒pHH43轉(zhuǎn)化于致病性E.coliO78后，42℃誘導(dǎo)，菌液OD600nm值持續(xù)呈上升趨勢(shì)，與常月紅報(bào)道的胸膜肺炎桿菌菌蛻在升溫誘導(dǎo)后，菌液OD600nm值始終無(wú)明顯的升高或下降，整體曲線非常平緩的試驗(yàn)結(jié)果不一致，這是否與宿主菌的固有性狀有關(guān)，有待進(jìn)一步探討[9]。

菌蛻的誘導(dǎo)不能完全裂解宿主菌，未被裂解的存活菌膜上存在E蛋白，在凍干時(shí)易破裂，因此冷凍干燥可讓其滅活。本實(shí)驗(yàn)將致病性E.coliO78/pHH43菌蛻冷凍干燥也未能使其完全滅活，加入慶大霉素124 μg/mL(終濃度)后使其完全滅活。

菌蛻與傳統(tǒng)滅活苗相比，沒(méi)有福爾馬林對(duì)機(jī)體的不良刺激，菌蛻本身具有佐劑效應(yīng)[10-11]；菌蛻缺乏遺傳物質(zhì)，因此作為疫苗進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，消除了耐藥基因或毒力島基因的水平轉(zhuǎn)移引起的潛在風(fēng)險(xiǎn)，比傳統(tǒng)滅活疫苗(含細(xì)菌全部DNA)具有更高的生物安全性。

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