劉慶堂，職愛民，李青梅，柴書軍，趙 東，張 磊，鄧瑞廣，張改平

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點開放實驗室，河南鄭州450002)

諾氟沙星(Norfloxacin，NFLX)是第3代氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones，F(xiàn)QNS)重要的一種，具有廣譜抗菌作用，主要用于治療畜禽細(xì)菌性疾病和支原體感染，尤其對需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高，而且在體外對多重耐藥菌亦具抗菌活性，因此被廣泛大量地添加到飼料中，應(yīng)用于畜禽疾病的治療和預(yù)防。然而，NFLX進入畜禽機體后，在動物體內(nèi)消除緩慢，半衰期長，形成嚴(yán)重的殘留，造成對動物源性食品安全和人類食源性疾病的發(fā)生[1-2]，鑒于FQNS的毒副作用，世界各國都對其使用范圍和使用對象做出了限定，我國規(guī)定其最大殘留限量為50μg/L[3]。目前檢測NFLX殘留的方法多是高效液相質(zhì)譜(HPLC)和液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)[4-10]等理化方法，雖然可以精確測定，但存在需要昂貴儀器，樣品前處理復(fù)雜、繁瑣費時、不能現(xiàn)場操作等缺陷，限制了其應(yīng)用。免疫學(xué)分析方法具有靈敏、快速、特異、簡便等優(yōu)點，近年來在獸藥、農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用[11-14]。本研究應(yīng)用NFLX人工抗原免疫BALB/c小鼠，建立分泌抗NFLX MAb的雜交瘤細(xì)胞株，為免疫學(xué)檢測方法的建立和擁有自主知識產(chǎn)權(quán)檢測產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑與溶液 鹽酸諾氟沙星為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；BSA和OVA為Pierce產(chǎn)品；完全佐劑(Freund's complete adjuvant,FCA)、不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant,FIA)、細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、選擇培養(yǎng)基HAT、HT和PEG-1500為GIBCO產(chǎn)品；新生牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為Sigma產(chǎn)品；羊抗鼠酶標(biāo)二抗(GaMIgG-HRP)為華美生物工程有限公司產(chǎn)品；其它試劑均為AR級。NFLX標(biāo)準(zhǔn)液，0.01 mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)為稀釋液，根據(jù)需要配制；洗液(PBST)為PBS含0.05%Tween-20；包被液(CBS)為0.1 mol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液；間接ELISA和阻斷ELISA的封閉液、稀釋液為含5%豬血清的PBST；顯色液為TMB的醋酸-檸檬酸緩沖液；終止液為2 mol/L的硫酸溶液。

1.2 實驗動物和細(xì)胞 6周齡SPF級BALB/c小鼠購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心；小鼠骨髓瘤細(xì)胞株NS0由英國國家動物健康研究院惠贈。

1.3 人工抗原的合成與鑒定

1.3.1 人工抗原的合成 采用碳二亞胺法合成BSA-NFLX完全抗原。同法制得包被抗原OVA-NFLX。

1.3.2 人工抗原的鑒定

1.3.2.1 UV鑒定 用PBS配制NFLX和BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，取一定量的BSA-NFLX溶于PBS，測定其蛋白質(zhì)的濃度，據(jù)此濃度調(diào)節(jié)BSA-NFLX溶液中BSA的濃度與BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液一致，在波長200 nm～400 nm范圍內(nèi)進行紫外掃描，根據(jù)掃描結(jié)果判定偶聯(lián)效果。

1.3.2.2 SDS-PAGE鑒定 參照文獻報道[15]方法進行試驗，濃縮膠為5%(W/V)，分離膠為10%(W/V)，濃縮電壓為70 V，分離電壓為85 V，上樣量為20 μL，考馬斯亮藍(lán)染色5 h～6 h后，置脫色液中脫色過夜。

1.4 小鼠多抗血清(pAb)效價測定

1.4.1 小鼠免疫 用 0.22 μm濾膜無菌過濾的BSA-NFLX免疫6周齡雌性BALB/c小鼠3只，免疫劑量為50 μg 200 μL/只，背部皮下分4～6點注射。首免用無菌PBS溶解BSA-NFLX與等量FCA混合，充分乳化；加強免疫將PBS溶解的BSANFLX與等量FIA混合，首免后2周進行，共免疫4次，每次間隔2周，最后1次免疫后12 d斷尾采血分離血清。用間接ELISA檢測抗NFLX抗體效價，若效價>1.6×10-3即可用于細(xì)胞融合；超強免疫用無菌PBS溶解BSA-NFLX，最后1次加強免疫后4周，細(xì)胞融合前4 d，腹腔注射BSA-NFLX 50 μg 200 μL/只。

1.4.2 小鼠抗血清效價和敏感性測定

1.4.2.1 間接ELISA測定pAb的效價 基本程序參照Tijssen[16]的方法，具體如下：OVA-NFLX 1 μg/mL包被酶標(biāo)板并封閉，加入待檢血清，室溫孵育20 min，PBST洗滌3次；每個樣品孔中加入1∶1000稀釋的GaMIgG-HRP 50 μL，室溫孵育20 min，PBST洗板6次；每孔加入底物緩沖液A、底物緩沖液B混合液50 μL，室溫顯色反應(yīng)10 min，加入終止液50 μL終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值。

1.4.2.2 阻斷ELISA測定抗體敏感性 OVA-NFLX 1 μg/mL包被酶標(biāo)板并封閉，加入不同濃度的NFLX等標(biāo)準(zhǔn)液和工作濃度的待檢抗血清，設(shè)陰性和空白對照，室溫孵育20 min，PBST洗板3次，加入GaMIgG-HRP，室溫孵育20 min，PBST洗板6次，顯色10min，終止并讀取OD450nm值，計算IC50值。

1.5 雜交瘤細(xì)胞株的建立

1.5.1 融合備用鼠選擇 用阻斷ELISA篩選抑制價最低的小鼠作為融合備用小鼠。

1.5.2 細(xì)胞融合 用1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)NS0骨髓瘤細(xì)胞，于融合前2 d傳代培養(yǎng)；融合前1 d取昆明鼠一只，腹腔注入冷的HAT培養(yǎng)基6 mL～8 mL，輕輕揉動后抽出腹腔巨噬細(xì)胞并以50 μL/孔鋪于96細(xì)胞培養(yǎng)板中，作為飼養(yǎng)細(xì)胞，小鼠超強免疫后4 d，摘除眼球，眶下竇采血，分離陽性血清；脫頸致死小鼠，無菌取脾臟制備脾細(xì)胞，在50%PEG-1500作用下與NS0細(xì)胞融合；將融合后的細(xì)胞懸液加到已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用HAT培養(yǎng)基置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5.3 融合細(xì)胞的培養(yǎng)及陽性雜交瘤的篩選與克隆融合細(xì)胞于第10 d用HT培養(yǎng)液半量換液；用間接ELISA和阻斷ELISA進行陽性孔篩選，選擇強陽性、抑制率高、細(xì)胞生長旺盛的孔進行有限稀釋克隆化，而后擴大培養(yǎng)、凍存、鑒定和建株。

1.5.4 MAb制備 參照文獻[17]用體內(nèi)誘生腹水法制備MAb。

1.6 MAb免疫學(xué)特性鑒定

1.6.1 效價測定 間接ELISA測定其效價。

1.6.2 敏感性鑒定 用阻斷ELISA測定3C6 MAb對不同濃度NFLX的抑制率，以吸光率B/B0(B為NFLX不同濃度的OD450nm值，B0為NFLX 0標(biāo)準(zhǔn)濃度的OD450nm值)為縱坐標(biāo)，以不同濃度NFLX的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，進行相關(guān)回歸分析，計算3C6 MAb對NFLX的IC50。

1.6.3 特異性鑒定 NFLX及其同系喹諾酮類藥物作為抑制劑，用阻斷ELISA測定各抑制物的IC50，以MAb對NFLX的IC50與各抑制物的IC50之比的百分?jǐn)?shù)為其交叉反應(yīng)率(CR%)[18]。

2 結(jié)果

2.1 人工抗原鑒定結(jié)果 BSA的吸收峰在278 nm，NFLX的最大吸收峰在272 nm，325 nm處也有一吸收峰。BSA與NFLX偶聯(lián)后，280 nm處兩者的峰疊加，325 nm處也有NFLX特征峰出現(xiàn)，表明偶聯(lián)成功；依據(jù)朗伯-比爾定律，推算BSA與NFLX的分子結(jié)合比約為1∶16.8(圖 1)。SDS-PAGE鑒定顯示，BSA的泳動速度大于BSA-NFLX，表明BSANFLX的分子量大于BSA，證明偶聯(lián)成功(圖2)。

2.2 小鼠血清效價敏感性測定結(jié)果 免疫的3只小鼠血清抗體效價均達到10-4，獲得較好的免疫效果(圖3)，其中1號鼠血清效價較高，并且IC50最低(圖4)，用于細(xì)胞融合。

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立 細(xì)胞融合后10 d觀察融合效果，4塊細(xì)胞培養(yǎng)板384孔中有雜交瘤克隆形成的326孔，融合率為85%；間接ELISA檢測，強陽性23孔，強陽性率為7.1%；3次亞克隆后獲得4株雜交瘤，分別測定其IC50，篩選出2株雜交瘤，分別命名為3C6、3G11，經(jīng)多次傳代、凍存及復(fù)蘇，雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定。

2.4 MAb免疫學(xué)特性鑒定結(jié)果

2.4.1 效價測定結(jié)果 雜交瘤分泌的抗NFLX MAb具有較高的效價，兩株雜交瘤3C6和3G11株效價相似，細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水效價分別達到1∶5.12×102和 1∶6.4×105(表 1)。

2.4.2 敏感性鑒定結(jié)果 3C6 MAb標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的線性回歸方程為y＝-37.043x+85.918，根據(jù)回歸方程計算出 3C6 MAb對 NFLX 的 IC50為 2.52 μg/L，本實驗所獲得的MAb對NFLX具有較高的敏感性(圖 5)。

表1 NFLX MAb的間接ELISA效價Table 1 The indirect ELISA titer of NFLX MAb

2.4.3 交叉反應(yīng)試驗 NFLX的 IC50為 2.52 μg/L，NFLX MAb對二氟沙星有0.028%的交叉反應(yīng)性，對沙拉沙星有小于0.016%的交叉反應(yīng)性，對其它抑制物無交叉反應(yīng)(表2)。

3 討論

為獲得穩(wěn)定分泌抗目標(biāo)抗原抗體的雜交瘤細(xì)胞株，免疫抗原須具備較高的純度和合適的偶聯(lián)比率，針對不同免疫對象應(yīng)用不同的載體蛋白、劑量、佐劑和免疫周期，激發(fā)受免動物對該抗原的適度免疫應(yīng)答，以利于獲得高特異性、高親和力的抗體。本實驗使用高純度的完全抗原免疫，適量的免疫劑量和周期，獲得了較為理想的免疫效果，免疫小鼠多抗血清的半數(shù)抑制已經(jīng)滿足了國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測需求。高特異性、高親和力MAb的獲得，除了良好的免疫效果外，還需要有效的篩選系統(tǒng)。本實驗免疫多抗血清使用阻斷ELISA，用來甄別遴選具備高效價高親和力的小鼠，使用親和力最高的小鼠進行MAb制備，并以此獲得了理想的雜交瘤細(xì)胞株。MAb的特異性由同類藥物對NFLX抗體的交叉反應(yīng)來體現(xiàn)，除與二氟沙星和沙拉沙星有較小的交叉反應(yīng)以外，與其抑制物的交叉反應(yīng)性都低于0.01%，表明本實驗制備的NFLX雜交瘤細(xì)胞株具備較高的特異性。本研究合成NFLX完全抗原，獲得了滿意的免疫效果，通過雜交瘤技術(shù)獲得2株高親和力和高特異性的、穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為NFLX殘留快速檢測產(chǎn)品的研制提供了保證。

表2 NFLX MAb與其他藥物的交叉反應(yīng)Table 2 The cross-reactivity of NFLX MAb with other compounds

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