魏 峰，殷麗紅，許 越，楊歡歡，張西臣

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062)

柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)是球蟲病爆發(fā)中致病性最強的蟲種之一，主要侵害雞盲腸，通過裂殖體在盲腸上皮細胞中大量增殖，破壞腸黏膜，引起腸管發(fā)炎和上皮細胞崩解[1-2]。目前，藥物防治多采用抗生素類和化學(xué)合成藥物，但由于耐藥蟲株的出現(xiàn)及殘留藥物對人體的危害，使藥物防治受到限制[3]。免疫預(yù)防已成為當前研究的熱點，但目前對球蟲的免疫機制尚未完全闡明，同種不同株、不同發(fā)育階段的蟲體抗原成分均存在一定的差異。因此，鑒定其共同保護性抗原對球蟲疫苗的研制及免疫機理的研究具有重要的意義。吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部寄生蟲研究室利用E.tenella廣州株、長春株、黑龍江株雜交獲得雜交株，為研究球蟲共同保護性抗原奠定基礎(chǔ)[4]。本研究通過E.tenella雜交株對其親本株的免疫保護性實驗，研究雜交株對親本株的免疫保護及細胞免疫在球蟲免疫中的作用，從而，為球蟲免疫機理研究和疫苗研制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蟲株E.tenella廣州株為廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔡建平研究員惠贈；E.tenella長春株及黑龍江株均為吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部寄生蟲研究室保存；E.tenella雜交株為吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部寄生蟲研究室利用E.tenella廣州株、長春株和黑龍江株雜交獲得。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng) 1日齡AA肉雞500只購自吉林德大肉種雞公司，自行配制無抗球蟲藥全價飼料，80℃烘烤1 h，自由采食、飲水，24 h光照，嚴格消毒，在無球蟲環(huán)境下飼養(yǎng)，10日齡～11日齡連續(xù)2 d糞檢無球蟲卵囊雞用于試驗。

1.3 免疫保護性檢測

1.3.1 免疫保護率測定 12日齡時逐只稱重，淘汰體重過大和過小者，400只無球蟲雛雞隨機分為20組，每組20只；用E.tenella廣州株、長春株、黑龍江株、雜交株各感染4組，劑量為1×104個卵囊/只，設(shè)4個不感染對照組。24日齡時分別用廣州株、長春株、黑龍江株和雜交株對各組雞攻蟲，劑量為103個卵囊/只；攻蟲后7 d進行OPG計數(shù)、糞便計分、盲腸病變計分[5]、平均增重和保護率計算，分析各數(shù)據(jù)(表1)。

保護率＝(各株空白組攻蟲OPG數(shù)-各株攻蟲后OPG數(shù))/各株空白組攻蟲OPG數(shù)

1.3.2 細胞免疫檢測 50只12日齡無球蟲AA肉雞隨機分成1個空白對照組，4個實驗組，每組10只。實驗組12日齡用雜交株感染，劑量為104個卵囊/只，24日齡時分別用廣州株、長春株、黑龍江株和雜交株攻蟲，劑量為103個卵囊/只，攻蟲后10 d，各組雞翅下采血1 mL，抗凝處理后進行鼠抗雞CD4+T、CD8+T單克隆抗體(MAb)標記，標記血樣利用流式細胞儀檢測CD4+T、CD8+T細胞水平，比較各親本株攻蟲后對雞細胞免疫的影響(表2)。

表1 雜交株及各親本株免疫保護性Table 1 Immuneprotection of chickens immunized withE.teuellahybrid strain against different parent strain challenging(n=20)

表2 雜交株免疫雛雞對親本株攻蟲后CD4+T、CD8+T細胞檢測Table 2 CD4+T and CD8+T cell level of chickens immunized with hybird strain and challenged by parent strains(n=10)

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫保護率結(jié)果 表1結(jié)果顯示：E.tenella雜交株、廣州株、長春株和黑龍江株對同株的免疫保護率分別為87.7%、83.6%、72.5%和75.1%；廣州株、長春株和黑龍江株對其它親本株的平均免疫保護率為64.9%、60.4%和65.1%，而雜交株免疫的雛雞對廣州株、長春株和黑龍江株3個親本株的免疫保護率分別為83.9%、79.1%和81.2%，平均為81.4%，極顯著高于其它地理株的交叉保護率(p<0.01)。雜交株對其親本株的免疫保護率較高，而各親本株對其他株的攻蟲免疫保護率較低，免疫保護率順序為：雜交株(81.4%)>黑龍江株(65.1%)>廣州株(64.9%)>長春株(60.4%)，雜交株可能遺傳了3個親本株的某些性狀(如抗原等)，特別是雜交株對長春株和黑龍江株的免疫保護率高于其他株，其原因有待于進一步研究。而盲腸病變計分和糞便計分試驗結(jié)果顯示：雜交株顯著低于廣州株、長春株和黑龍江株(p<0.05)；所有免疫組雛雞平均增重均高于空白對照組，表明經(jīng)過免疫后雛雞獲得保護力，能夠抵抗球蟲的再次感染。各株的致病性有明顯差異，其順序為(以O(shè)PG計)：廣州株>長春株>黑龍江株>雜交株，雜交株致病性較弱而其免疫保護率較高。對球蟲免疫研究顯示，不同種的球蟲抗原存在差異，同種不同株間也存在著抗原差異，同一個體的不同發(fā)育階段抗原也不相同。本實驗結(jié)果表明E.tenella廣州株、長春株和黑龍江株之間存在抗原差異。

2.2 細胞免疫結(jié)果 表2結(jié)果顯示：4個試驗組的雛雞外周血液中CD4+T、CD8+T細胞數(shù)量均顯著高于對照組，其中以雜交株和廣東株較高，各組引起的CD4+T數(shù)量增加明顯高于CD8+T數(shù)量增加，CD4+T/CD8+T差別不大，表明不同雜交株球蟲感染能夠引起明顯的細胞免疫。在球蟲的免疫機制中抗體的作用很小[6]，CD4+T、CD8+T細胞在免疫中發(fā)揮著重要作用[7-8]，本實驗中，CD4+T、CD8+T細胞在攻蟲10 d后其數(shù)量均有明顯增加，尤其是CD4+T細胞增加較多，試驗組CD4+T/CD8+T比值顯著高于對照組。該實驗結(jié)果與Shirle對耐藥雜交株可耐受多種藥物的結(jié)果相似，也與吉林大學(xué)分子寄生蟲學(xué)研究室的研究結(jié)果相似[9-10]。這些研究為雞球蟲活苗在不同地區(qū)的正確使用提供了依據(jù)，為下一步找出球蟲保護性抗原奠定了基礎(chǔ)。

[1]Dalloul R A,Lillehoj H S.Recent advances in immunomo-dulation and vaccination strategies against coccidiosis[J].Avian Dis,2005,49:1-8.

[2]Allen P C,Fetterer R H.Recent advances in biology and immunobiology of Eimeriaspecies and in diagnosis and control of infection with these coccidian parasites of poultry[J].Clin Microbiol Rev,2002,15:58-65.

[3]Vertommen M H,Deek H W.How can a resistance problem be broken[J].World Poultry,1993,9:19-21.

[4]趙權(quán)，張西臣.不同地理株及其雜交株柔嫩艾美耳球蟲免疫保護性研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，27(1)：100-103.

[5]索勛，李國清.球蟲病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998，357-396.

[6]段嘉樹，程金科，趙樹英，等.球蟲疫苗免疫防治縱橫談[J].當代畜牧，1994，12：13-20.

[7]查紅波，蔣金書.球蟲保護性免疫機制[J].中國獸醫(yī)雜志1997，23(11)：47-48.

[8]Arakawa A,Xie M Q.Control of coccidiosis in chickens[J].J Protozool Res,1993,3:31-39.

[9]Shirley M W.A molecular karyotype of Eimeria tenellaasrevealed by contourclamped homogenous electric field gel electrophoresis[J].Mol Biochem Parasitol,1990,38:169.

[10]張偉信，張西臣，李建華，等.五種不同地理株柔嫩艾美耳球蟲免疫保護性比較[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2006，4：454-456.