徐 佳，邵昱昊，韓宗璽，李慧昕，孔憲剛，劉勝旺

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150001)

雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)為Nido病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬抗原三群的代表[1]，能引起雞的急性、高度接觸性傳染病。呼吸道上皮細(xì)胞為IBV的主要增殖部位，感染雞表現(xiàn)呼吸道癥狀。但部分病毒株也可以在感染雞的腎臟、輸卵管和腸道等組織器官的上皮細(xì)胞中復(fù)制和增殖，損害腎臟，造成感染雞死亡，蛋雞產(chǎn)蛋量下降，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

IBV含有4種結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)。IBV的N蛋白由mRNA65'端獨(dú)特區(qū)編碼，分子量約為45 ku，磷酸化后分子量約為51 ku，占病毒蛋白總量的40%。N蛋白對(duì)病毒基因組的復(fù)制、亞基因組RNA轉(zhuǎn)錄、翻譯具有一定作用。而且N蛋白具有良好的免疫原性，是誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要免疫原蛋白[2]。

本研究應(yīng)用雜交瘤技術(shù)獲得分泌抗IBV N蛋白MAb的雜交瘤細(xì)胞株，為建立雞傳染性支氣管炎(IB)檢測(cè)方法及相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料 IBV tl/CH/LDT3/03[3]、IBV分離株CK/CH/LDL/97Ⅰ、IBN、M41、CK/CH/LSD/05Ⅰ、CK/CH/LHN/00Ⅰ和CK/CH/LAH/08Ⅱ的N蛋白、BL21(DE3)和SP2/0細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；雌性BALB/c小鼠由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；pGEX-6p-1購(gòu)自Amersham-Pharmacia公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購(gòu)自SEPPIC MONTANIDETM公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、HAT、HT和聚乙二醇(PEG1450)均購(gòu)自Invirogen公司；MAb亞類(lèi)鑒定試劑盒購(gòu)自Southern Biotech公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠lgG購(gòu)自Sigma公司。

1.2 抗原的制備 將tl/CH/LDT3/03分離株尿囊腔接種9日齡～11日齡SPF雞胚，37℃培養(yǎng)72 h，收集尿囊液。1000 r/min 4℃離心30 min，收集上清，3500 r/min離心30 min，將上清12000 r/min離心30 min，收集上清。100000 r/min超速離心3 h?；厥粘恋恚贤夥止夤舛扔?jì)測(cè)定濃度。

1.3 動(dòng)物免疫 取適量濃縮的抗原與等量弗氏完全佐劑乳化，皮下和腹腔免疫6周齡～8周齡BALB/c小鼠(0.2 mL/只)，2周后將適量抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，進(jìn)行第2次免疫，14 d后三免，融合前3 d經(jīng)尾靜脈注射加強(qiáng)免疫1次。

1.4 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選 加強(qiáng)免疫后的小鼠脾細(xì)胞采用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后10 d，以N蛋白作為檢測(cè)抗原，采用western blot方法進(jìn)行篩選，將獲得的穩(wěn)定分泌MAb的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并保存于液氮中。

1.5 MAb亞類(lèi)的鑒定 按照Southern Biotech公司MAb亞類(lèi)鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 雜交瘤細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù) 以秋水仙素預(yù)處理雜交瘤細(xì)胞，0.075 mol/L KCl溶液低滲處理，經(jīng)甲醇-冰醋酸溶液固定，用Giemsa染液染色并進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。

1.7 MAb表位的初步鑒定

1.7.1 IBV N基因的分段克隆、表達(dá)及鑒定 根據(jù)對(duì)tl/CH/LDT3/03株N基因核苷酸序列分析，設(shè)計(jì)5對(duì)引物，分別克隆至pGEX-6p-1載體中，并轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，將表達(dá)的6種蛋白依次 命 名 為 GST-N、GST-N1、GST-N2、GST-N3、GST-N4和GST-N5。在N1上設(shè)計(jì)3對(duì)引物，分別克隆到pGEX-6p-1載體中，分別轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，將表達(dá)的3種蛋白依次命名為GST-N1-1、GST-N1-2、GST-N1-3(圖 1)。

圖1 分段表達(dá)的蛋白在N蛋白中對(duì)應(yīng)的氨基酸位置Fig.1 Location of expressed N fragments in full length N gene

1.7.2 抗原表位的初步定位 將表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE及western blot鑒定，其中，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，DAB顯色。

1.7.3 ELISA檢測(cè)MAb與N基因表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)性 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和western blot鑒定，對(duì)第一輪表達(dá)的6段蛋白進(jìn)行切膠純化，分別按10 μg/孔包被酶標(biāo)板，同時(shí)設(shè)空載體誘導(dǎo)產(chǎn)物對(duì)照。BSA溶液37℃封閉2 h，分別加入MAb，37℃反應(yīng)1.5 h，1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 37℃反應(yīng)1.5 h，OPD顯色，檢測(cè)OD490nm值。

1.8 MAb 6F9與其他IBV分離株核蛋白反應(yīng)性將接種不同IBV分離株的雞胚尿囊液進(jìn)行SDS-PAGE分析，并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，4℃封閉過(guò)夜，加入雜交瘤細(xì)胞上清，37℃反應(yīng)2 h，1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 37℃反應(yīng)2 h，DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選 經(jīng)克隆、篩選獲得兩株穩(wěn)定分泌針對(duì)IBV N蛋白的MAb，分別命名為6H3和6F9。

2.2 MAb亞型的鑒定 利用MAb亞型鑒定試劑盒對(duì)得到的兩株MAb進(jìn)行亞型鑒定結(jié)果顯示：6H3為IgG1，6F9為IgG2b，兩株MAb的輕鏈均為κ鏈。

2.3 雜交瘤細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù) 染色體計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：分泌MAb 6H3的雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目為90，分泌MAb 6F9的雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目為102。

2.4 MAb 6H3、6F9抗原表位的初步定位

2.4.1 IBV N基因的分段克隆、表達(dá)及western blot分析 收集陽(yáng)性重組菌，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示目的蛋白均得到表達(dá)，并且與預(yù)期大小相符(圖 2)，western blot分析結(jié)果顯示 MAb 6H3與GST-N、GST-N1和 GST-N2及 MAb 6F9與 GST-N和GST-N1反應(yīng)均呈陽(yáng)性(圖3、4)。

2.4.2 MAb與N基因表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)性的ELISA檢測(cè) 純化的6段蛋白作為包被抗原，用pGEX-6p-1空載體誘導(dǎo)物作陰性對(duì)照進(jìn)行間接ELISA。結(jié)果顯示：MAb 6H3與GST-N、GST-N1和GST-N2呈陽(yáng)性反應(yīng)，MAb 6F9與GST-N和GST-N1呈陽(yáng)性反應(yīng)(圖5)，這與western blot分析結(jié)果一致。

圖5 MAb 6H3和6F9檢測(cè)各蛋白的間接ELISA結(jié)果Fig.5 Reactivity of different GST truncated N protein with the 6H3 and 6F9 by indirect ELISA

2.4.3 IBV N1基因的表達(dá)以及western blot分析SDS-PAGE結(jié)果顯示，GST-N1-1、GST-N1-2、GSTN1-3均得到表達(dá)，與預(yù)期大小相符(圖6-A)。MAb 6F9的western blot結(jié)果顯示，MAb 6F9與GST-N1-2和GST-N1-3均呈陽(yáng)性反應(yīng)(圖6-B)。

圖 6 IBV N1基因分段表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE(A)與western blot分析(B)Fig.6 SDS-PAGE analysis of expressed N1 protein(A)and western blot analysis of expressed N1 protein with MAb 6F9(B)

2.5 MAb 6F9與其他IBV反應(yīng)結(jié)果 MAb 6F9可與 CK/CH/LDL/97Ⅰ、IBN、M41、CK/CH/LSD/05Ⅰ和CK/CH/LHN/00Ⅰ的N蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而與CK/CH/LAH/08Ⅱ反應(yīng)呈陰性(圖7)。

3 討論

圖7 MAb 6F9與IBV N蛋白的western blot分析Fig.7 Binding activity of MAb 6F9 with N protein of other IBV isolates by western blot

以往研究認(rèn)為IBV N基因進(jìn)化比較保守[5-6]，但劉勝旺等研究表明，在N基因內(nèi)部存在點(diǎn)突變現(xiàn)象[7]?？赡軐?dǎo)致N蛋白抗原表位及功能變化，其中有些變異可能改變病毒的某些生物學(xué)特性[5]。IBV tl/CH/LDT3/03是本實(shí)驗(yàn)室2003年從水鴨中分離出的一株病毒，該分離株主要致腎臟病變[4]，用該病毒免疫小鼠，得到針對(duì)該株病毒N蛋白的兩株MAb 6H3和6F9，其中MAb 6F9與另外5株不同致病性和組織嗜性的IBV分離株CK/CH/LDL/97Ⅰ、IBN、M41、CK/CH/LHN/00Ⅰ和 CK/CH/LSD/05Ⅰ的N蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，推測(cè)這5個(gè)分離株與tl/CH/LDT3/03具有相同的一個(gè)線(xiàn)性表位。而CK/CH/LAH/08Ⅱ在該表位上可能存在關(guān)鍵氨基酸的替換，導(dǎo)致與MAb 6F9不反應(yīng)。而有研究表明對(duì)不同IBV分離株的N蛋白進(jìn)行比對(duì)顯示，在氨基端100位內(nèi)存在幾個(gè)氨基酸替換，而在羧基端卻很保守[5]。這些氨基酸的替換可能影響表位的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變病毒N蛋白的抗原性。

目前，關(guān)于IBV N蛋白特異性抗原表位的研究報(bào)道較少。Boot等在IBV N蛋白的aa 71～aa 78位鑒定出一個(gè)T細(xì)胞表位[8]。Ignjatovic等利用MAb對(duì)N蛋白進(jìn)行抗原表位分析，發(fā)現(xiàn)8個(gè)MAb(1、7、9、16、24、26、27和51)能直接與N蛋白7個(gè)非重疊表位結(jié)合，表明N蛋白至少有7個(gè)以上抗原表位[9]。Seah等利用雞的康復(fù)血清對(duì)M41 IBV分離株核蛋白的線(xiàn)性B細(xì)胞表位進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)線(xiàn)性免疫優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位主要分布于7個(gè)片段中：aa 1～aa 50、aa 40～aa 90、aa 140～aa 180、aa 175～aa 209、aa 195～aa 241、aa 310～aa 370和 aa 360～aa 409，其中在aa 40～aa 90和aa 140～aa 180兩個(gè)片段陽(yáng)性反應(yīng)較弱，這可能由于2個(gè)片段中存在較少的表位[10]。本研究得到的MAb 6H3表位初步定位在aa 80～aa 99，而MAb 6F9表位初步定位在aa 64～aa 82，位于aa 40～aa 90，其精確的表位鑒定有待進(jìn)一步研究。

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