杜青青，王戰(zhàn)國，劉芳，蔣學(xué)華（四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都市 610041）

口服給藥是中藥復(fù)方臨床應(yīng)用最常用的給藥形式，吸收是中藥復(fù)方發(fā)揮臨床效應(yīng)的前提。中藥有效成分之間的相互作用[1]已成為大家關(guān)注的焦點，而復(fù)方制劑腸吸收相互作用又與臨床療效密切相關(guān)。筆者以瀉心湯藥效成分黃芩苷、鹽酸小檗堿為研究對象，采用大鼠原位灌注模型進(jìn)行其腸吸收相互作用初步研究[2]，以期為瀉心湯藥效成分配伍[3]體內(nèi)藥動學(xué)相互作用研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010C HT型高效液相色譜（HPLC）儀（日本Shimadu公司）；Votex Genius 3型旋渦混合儀（德國IKA公司）；恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療設(shè)備總廠）；Anke TGL-16C型臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

黃芩苷對照品（批號：110715-200514）、鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-200609）由中國藥品生物制品檢定所提供；酚紅標(biāo)準(zhǔn)品（天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，批號：20040111）；黃芩苷提取物（批號：060812，含量≥98%）、鹽酸小檗堿提取物（批號：060204，含量≥95%）由四川升和制藥有限公司提供；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SD大鼠，♂，體質(zhì)量（200±20）g，購自四川大學(xué)實驗動物中心（動物合格證號：川實動管質(zhì)第10號）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 Kerbs-Ringer溶液（KR溶液，pH 7.4）：稱取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl20.02 g、葡萄糖1.40 g，加水定容至1 L。

2.1.2 酚紅KR溶液：取酚紅20.1 mg，精密稱定，KR溶液（含0.2%Vit C）稀釋定容至1 L。

2.1.3 空白腸循環(huán)灌注液：將KR溶液（含0.2%Vit C）照大鼠原位腸循環(huán)灌注法循環(huán)3 h，中止實驗，即得空白腸循環(huán)灌注液。

2.1.4 混合對照品溶液：取黃芩苷對照品10.24 mg、鹽酸小檗堿對照品11.80 mg和酚紅標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，4℃貯藏，作為混合對照品溶液。

2.1.5 黃芩苷供試品溶液：分別取黃芩苷提取物31.42 mg、酚紅標(biāo)準(zhǔn)品20.1 mg，精密稱定，用KR溶液（含0.2%Vit C）稀釋定容至1 L。

2.1.6 鹽酸小檗堿供試品溶液：分別取鹽酸小檗堿提取物10.10 mg、酚紅標(biāo)準(zhǔn)品20.1 mg，精密稱定，用KR溶液（含0.2%Vit C）稀釋定容至1 L。

2.1.7 混合供試品溶液：分別取黃芩苷提取物31.5 mg、鹽酸小檗堿提取物10.02 mg、酚紅標(biāo)準(zhǔn)品20.10 mg，精密稱定，用KR溶液（含0.2%Vit C）稀釋定容至1 L。

2.2 大鼠小腸吸收實驗設(shè)計

選實驗前禁食12 h（自由飲水）的SD大鼠15只，隨機(jī)分成3組，分別用“2.1”項下“黃芩苷供試品溶液”、“鹽酸小檗堿供試品溶液”和“混合供試品溶液”進(jìn)行實驗。將大鼠ip戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1），麻醉后固定。沿腹中線打開腹腔（2～3 cm），結(jié)扎膽管，于十二指腸上部和回盲腸末端各切一小口，在上端小口處插入直徑為0.3 cm的玻璃管，并用線扎緊。用注射器將37℃的生理鹽水緩緩注入腸管，洗去腸管內(nèi)容物至凈，然后在實驗?zāi)c管下端小口處插入玻璃管，并用線扎緊。將腸管兩端的玻璃管與蠕動泵的膠管連接，形成回路，開動蠕動泵。腸灌注液以5 mL·min-1流速循環(huán)10 min后，將流速調(diào)節(jié)為2.5 mL·min-1，立即自灌注液錐形瓶中取樣0.4 mL，同時向錐形瓶中補(bǔ)加酚紅KR溶液0.4 mL，其后每隔15 min亦按同法取樣并補(bǔ)加酚紅KR溶液，循環(huán)3 h后中止實驗。

2.3 樣品檢測

取循環(huán)樣品供試液0.4 mL，用甲醇0.8 mL稀釋，混旋1 min，15000 r·min-1離心5 min，取上清液10 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，用回歸方程計算腸循環(huán)液中黃芩苷和鹽酸小檗堿的濃度。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0中的Indepent-Samples t Test檢驗，考察黃芩苷、鹽酸小檗堿單獨給藥以及配伍后各組的吸收速率常數(shù)（ka）和吸收率（A）是否有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.5 黃芩苷、鹽酸小檗堿和酚紅HPLC測定方法

2.5.1 色譜條件：色譜柱為Welchrom-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水-磷酸-三乙胺（30∶70∶0.2∶0.1），柱溫為30℃，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為270 nm。

2.5.2 專屬性考察：分別取空白腸循環(huán)灌注液、混合對照品溶液、混合腸循環(huán)灌注液，按“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定。結(jié)果表明，酚紅、黃芩苷和鹽酸小檗堿的保留時間分別為4.6、6.9和10.2 min；供試液中其它成分不干擾測定。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白腸循環(huán)灌注液；B.混合對照品溶液；C.混合供試品溶液；1.酚紅；2.黃芩苷；3.鹽酸小檗堿Fig 1 HPLC chromatogramA.blank circumfusion solution；B.circumfusion control；C.circumfusion sample；1.phenolsulfonphthalein；2.baicalin；3.berberine

2.5.3 線性關(guān)系考察：倍數(shù)稀釋法配制混合對照品系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣10 μL。以峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得黃芩苷的回歸方程為A＝28243.76C－40.01（r＝0.9999），線性范圍為1.60～102.40 μg·mL-1；鹽酸小檗堿的回歸方程為 A＝41317.40C+2059.40（r＝0.9999），線性范圍為1.84～118.00 μg·mL-1；酚紅的回歸方程為A＝14424.71C－203.54（r＝0.9999），線性范圍為3.13～50.00 μg·mL-1。

2.5.4 精密度試驗：（1）分別吸取低、中、高濃度的混合對照品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣10 μL，根據(jù)回歸方程計算各溶液濃度。結(jié)果，高、中、低濃度黃芩苷、鹽酸小檗堿和酚紅日內(nèi)RSD分別為0.13%、0.18%、0.22%；0.24%、0.22%、0.14%；0.80%、0.64%、0.93%。（2）分別在1、2、3 d吸取高、中、低濃度的混合對照品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣10 μL，根據(jù)回歸方程計算各樣品濃度，高、中、低濃度黃芩苷、鹽酸小檗堿和酚紅日間精密度分別為0.23%、0.12%、0.18%；0.19%、0.12%、0.17%；1.25%、1.11%、0.69%。結(jié)果表明，3個組分的日內(nèi)、日間精密度均良好。

2.5.5 穩(wěn)定性考察：黃芩苷、鹽酸小檗堿與酚紅在含有Vit C的KR溶液（37℃）中3 h內(nèi)穩(wěn)定，在甲醇處理后的樣品溶液中24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6 回收率試驗：取不同體積混合對照品貯備液，置于10 mL容量瓶中，用空白KR液-甲醇（1∶2，V/V）稀釋至刻度，搖勻，得高、中、低濃度的對照品工作液。按“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定，以測定濃度與加入濃度之比計算回收率。結(jié)果，高、中、低濃度黃芩苷回收率分別為（100.61±0.22）%、（99.49±0.18）%、（99.30±0.13）%；高、中、低濃度鹽酸小檗堿回收率分別為（99.68±0.14）%、（99.83±0.22）%、（100.84±0.24）%；高、中、低濃度酚紅回收率分別為（97.53±0.67）%、（98.17±1.08）%、（98.90±1.23）%。

2.6 黃芩苷與鹽酸小檗堿配伍前后大鼠小腸吸收動力學(xué)特征

黃芩苷在配伍鹽酸小檗堿前、后的ka具有顯著性差異（P＜0.05），但其A無顯著性差異；鹽酸小檗堿在配伍黃芩苷前、后的ka和A均有顯著性差異（P＜0.05）。黃芩苷與鹽酸小檗堿配伍研究中大鼠小腸吸收動力學(xué)特征見表1。

表1 黃芩苷與鹽酸小檗堿配伍研究中大鼠小腸吸收動力學(xué)特征（，n＝5）Tab 1 Absorptive kinetics characteristics of rats’small intestine in study of compatibility of baicalin and baicalein（，n＝5）

表1 黃芩苷與鹽酸小檗堿配伍研究中大鼠小腸吸收動力學(xué)特征（，n＝5）Tab 1 Absorptive kinetics characteristics of rats’small intestine in study of compatibility of baicalin and baicalein（，n＝5）

與配伍前黃芩苷組比較：＊P＜0.05；與配伍前鹽酸小檗堿組比較：#P＜0.05vs.baicalin perfused alone group：＊P＜0.05；vs.berberine perfused alone group：#P＜0.05

配伍前后配伍前A/%5.92±1.393.47±0.644.27±1.235.18±0.83#配伍后黃芩苷鹽酸小檗堿黃芩苷鹽酸小檗堿成分 參數(shù)ka/h-1 0.068±0.0020.044±0.0030.060±0.002＊0.057±0.006#

3 討論

研究結(jié)果表明，鹽酸小檗堿可以抑制黃芩苷的小腸降解或吸收；黃芩苷可以促進(jìn)鹽酸小檗堿的小腸吸收。黃芩苷在吸收前有代謝與降解反應(yīng)[4，5]發(fā)生，故不能將藥量減少計算出來的ka作為黃芩苷的小腸吸收常數(shù)，而應(yīng)該是腸道代謝、降解和吸收的共同作用。此過程較為復(fù)雜，本研究只對其配伍之后產(chǎn)生的總體結(jié)果進(jìn)行了分析，若要研究黃芩苷的腸道代謝、降解和吸收機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。

研究中黃芩苷和鹽酸小檗堿配伍應(yīng)用，黃芩苷的降解或吸收受到抑制，可能對其吸收和代謝均具有一定作用，此時黃芩苷在小腸中的停留時間增長，進(jìn)入血液的量減少，對其藥效作用的發(fā)揮可能產(chǎn)生影響，推測黃芩苷在腸道內(nèi)的存在時間延長與其藥效的發(fā)揮之間存在一定關(guān)系，這些有待進(jìn)一步的科學(xué)實驗進(jìn)行論證。研究證實，鹽酸小檗堿配伍黃芩苷后的吸收速率與量均發(fā)生變化，這可為瀉心湯藥效成分配伍吸收過程中的相互作用研究提供參考。

[1]肖春芬，周 莉，婁兆文.國內(nèi)有關(guān)數(shù)種中藥有效成分間相互作用的研究現(xiàn)狀[J].中國藥房，2007，18（15）：32.

[2]劉太明，蔣學(xué)華，張梅娟，等.黃芩苷和黃芩素的大鼠在體腸吸收特性[J].中國藥學(xué)雜志，2006，41（23）：1784.

[3]魯佳慧，江 濱，曾元兒.中藥配伍的研究進(jìn)展[J].時珍國醫(yī)國藥，2003，14（7）：419.

[4]Pieter B，Armorel DE.Comparative in vitro permeability of human vaginal，small intestinal and colonic mucosa[J].Int J Pharm，2003，261（1）：147.

[5]Parvin ZM，Mohammad BJ，Hosniyeh T，et al.Simultaneous determination of naproxen，ketoprofen and phenol red in samples from rat intestinal permeability studies：HPLC method development and validation[J].J Pharmaceut Biomed，2005，39（3）：624.