林妮，呂俊華，潘競鏘，肖柳英（1.廣州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，廣州市 51010；.暨南大學藥學院藥理研究室，廣州市 5106；.廣州市中醫(yī)醫(yī)院/廣州市中醫(yī)中藥研究所藥理研究室，廣州市 51010）

乳腺增生病是婦女的一種常見病和多發(fā)病，發(fā)病年齡集中于20～50歲，50歲以后發(fā)病率急劇下降，其發(fā)病率占育齡婦女的40%左右，占全部乳房病的75%，是最常見的乳房疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，乳腺增生病與內(nèi)分泌失調(diào)有關(guān)。

荔枝核含有氨基酸、多糖、總皂苷和黃酮類化合物等活性成分。大量的藥理實驗和醫(yī)學臨床證實，荔枝核具有降血糖、調(diào)血脂、抗氧化作用[1，2]。近年研究表明[3]，荔枝核能抑制雌激素性乳腺增生?。℉MG）大鼠乳腺組織增生，并調(diào)節(jié)病鼠性激素水平。本研究擬進一步探討荔枝核對HMG大鼠乳腺組織雌二醇受體（ER）和孕酮受體（PR）表達及細胞凋亡的作用。

1 材料

1.1 儀器

CX41-32RFL型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；－80℃冰箱（美國Thermo fora公司）；XSZ-D型倒置生物顯微鏡（重慶光學儀器廠）；低溫高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；RM2135型切片機（德國Leica公司）；FACS 440型流式細胞儀（美國Becton dickinson公司）。

1.2 試藥

荔枝核提取物顆粒（廣東一方制藥有限公司，批號：0604229）；苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批號分別為H20020529、H200205534）；乳結(jié)平（廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批號：H44025162）；SABC免疫組化染色試劑盒（批號：SA1026）、DAB顯色試劑盒（批號：AR1022）、ER試劑盒（批號：BA0345）、PR試劑盒（批號：BA0107）均購于武漢博士德生物工程有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物

SPF級SD未孕大鼠60只，♀，150～180 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供（動物合格證號：SCXX（粵）2003-0002）。

2 方法與結(jié)果

2.1 模型的復制

[4]復制模型，im苯甲酸雌二醇（0.5 mg·kg-1）25 d后，改im黃體酮（4 mg·kg-1）5 d，即得。

2.2 分組及給藥

實驗分為6組，即正常（蒸餾水）、模型（蒸餾水）、乳結(jié)平（3.3g·kg-1）及荔枝核高、中、低劑量（44 、22、11 g·kg-1）組，于復制模型第31天開始ig給藥，連續(xù)給藥30 d。

2.3 乳頭形態(tài)學指標測定

實驗開始后，連續(xù)觀察各組大鼠的一般狀況，未見大鼠進食、飲水和體質(zhì)量改變。每周用游標卡尺測量大鼠左側(cè)腋窩下第3對乳頭的直徑和高度1次。結(jié)果表明，復制模型后大鼠乳頭出現(xiàn)紅腫或增大，經(jīng)乳結(jié)平和荔枝核處理30 d后，病鼠乳頭紅腫或增生顯著減輕（P＜0.01）。荔枝核提取物對模型大鼠乳頭形態(tài)的影響見表1、表2。

表1 荔枝核提取物對模型大鼠乳頭直徑的影響（，n＝10）Tab 1 Effect of ESLon the diameter of nipples in HMG rats（，n＝10）

表1 荔枝核提取物對模型大鼠乳頭直徑的影響（，n＝10）Tab 1 Effect of ESLon the diameter of nipples in HMG rats（，n＝10）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.mormal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組乳結(jié)平組荔枝核高劑量組荔枝核中劑量組荔枝核低劑量組劑量/g·kg-1給藥后第3對乳頭直徑/mm給藥前乳頭直徑/mm 0.82±0.091.17±0.101.19±0.081.20±0.081.19±0.091.18±0.08--3.34422111周0.85±0.071.18±0.121.18±0.091.18±0.131.18±0.091.18±0.072周0.86±0.061.14±0.13＊1.09±0.08#1.08±0.111.09±0.121.08±0.173周0.88±0.061.16±0.11＊0.97±0.07##0.94±0.08##0.94±0.06##0.98±0.09##4周0.86±0.061.10±0.07＊0.92±0.08##0.90±0.08##0.91±0.06##0.96±0.08##

表2 荔枝核提取物對模型大鼠乳頭高度的影響（，n＝10）Tab 2 Effect of ESLon the height of nipples in HMG rats（，n＝10）

表2 荔枝核提取物對模型大鼠乳頭高度的影響（，n＝10）Tab 2 Effect of ESLon the height of nipples in HMG rats（，n＝10）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.mormal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組乳結(jié)平組荔枝核高劑量組荔枝核中劑量組荔枝核低劑量組給藥后第3對乳頭高度/mm劑量/g·kg-1--4周1.66±0.071.95±0.14＊1.65±0.08##1.70±0.06##1.66±0.16##1.68±0.10##3.3442211給藥前乳頭高度/mm 1.60±0.092.03±0.111.99±0.082.00±0.121.97±0.091.95±0.091周1.62±0.081.98±0.091.91±0.111.89±0.09#1.91±0.091.93±0.082周1.66±0.072.00±0.08＊1.80±0.08##1.82±0.07##1.80±0.06##1.85±0.073周1.68±0.091.97±0.12＊1.70±0.10##1.75±0.07##1.74±0.07##1.76±0.06##

2.4 乳腺組織ER和PR檢測[3]

末次給藥24 h后，按隨機數(shù)字表法從每組中隨機抽取6只大鼠，脫頸處死動物，經(jīng)乳頭基底部最大切面取下大鼠右側(cè)第2對完整乳腺組織，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)方法進行石蠟包埋，石蠟切片脫蠟脫水；參照文獻[4，5]方法進行免疫組化染色并觀察結(jié)果。ER和PR陽性判斷標準為乳腺導管和小葉上皮細胞核著色。陽性細胞率＜20%者為（-）；陽性細胞率不足20%，但局部區(qū)域有少量較強著色的陽性細胞者為（±）；陽性細胞率＞20%者，按陽性細胞數(shù)由少至多、著色由淺至深為+、++、+++、++++，并分別計1、2、3、4、5、6分，積分愈高表明ER和PR含量愈高。結(jié)果表明，模型組大鼠乳腺組織ER和PR表達顯著增強，與正常組大鼠比較有顯著差異（P＜0.01）；經(jīng)乳結(jié)平和荔枝核給藥各組處理后，乳腺組織ER和PR表達顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。荔枝核提取物對模型大鼠乳腺組織ER和PR表達的影響見表3。

2.5 乳腺組織細胞凋亡的檢測

取大鼠乳腺組織，于0.5 mL PBS液中剪碎，加入0.125%的胰酶消化液200μL，冰浴中消化5 min，加入含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基200μL停止消化。溶液過200目篩后4℃冷凍，1300 r·min-1離心 5 min，棄上清，細胞沉淀用 PBS液800～1000 r·min-1離心洗滌3次。收集細胞，調(diào)整細胞數(shù)為約每1 mL含1×106個，于預冷的70%乙醇中固定，4℃下貯藏；檢測前以1000 r·min-1離心5 min，棄上清后調(diào)整細胞數(shù)至每1 mL含1×106個，10 mg·L-1碘化丙啶室溫下染色30 min；尼龍網(wǎng)過濾，流式細胞儀檢測，經(jīng)計算機系統(tǒng)Cellquest軟件分析，繪制細胞數(shù)-DNA分布圖，計算凋亡細胞所占比例，用百分比表示。結(jié)果表明，正常、模型組大鼠乳腺組織出現(xiàn)的凋亡細胞較少，無顯著性差異（P＞0.05）；荔枝核提取物高、中劑量組大鼠乳腺組織出現(xiàn)較高的凋亡細胞（P＜0.01或P＜0.05）；荔枝核提取物低劑量、乳結(jié)平組的凋亡細胞變化較小，無顯著差異（P＞0.05）。荔枝核提取物對模型大鼠乳腺組織細胞凋亡的影響見表4。

表3 荔枝核提取物對模型大鼠乳腺組織ER和PR表達的影響（，n＝6）Tab 3 Effect of ESL on the expression of ER and PR of mammary tissue in HMG rats（，n＝6）

表3 荔枝核提取物對模型大鼠乳腺組織ER和PR表達的影響（，n＝6）Tab 3 Effect of ESL on the expression of ER and PR of mammary tissue in HMG rats（，n＝6）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.mormal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組乳結(jié)平組荔枝核高劑量組荔枝核中劑量組荔枝核低劑量組PR 2.50±0.544.50±0.55＊2.67±0.51##3.00±0.63##3.17±0.75#3.50±0.84劑量/g·kg-1--3.3442211 ER 2.33±0.524.34±0.81＊2.83±0.75#2.67±0.82##3.16±0.75#3.67±0.81

表4 荔枝核提取物對模型大鼠乳腺組織細胞凋亡的影響（，n＝3）Tab 4 Effect of ESL on apoptosis of mammary glandular cells in H MG rats（，n＝3）

表4 荔枝核提取物對模型大鼠乳腺組織細胞凋亡的影響（，n＝3）Tab 4 Effect of ESL on apoptosis of mammary glandular cells in H MG rats（，n＝3）

與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別正常組模型組乳結(jié)平組荔枝核高劑量組荔枝核中劑量組荔枝核低劑量組細胞凋亡率/%28.07±0.7632.33±0.9636.28±1.9556.49±3.35＊＊45.10±8.20＊37.34±0.79劑量/g·kg-1--3.3442211

2.6 子宮指數(shù)的計算

分別剖取大鼠的子宮稱重，與相應大鼠的體質(zhì)量進行換算，得出子宮指數(shù)。結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠子宮指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，荔枝核高、中劑量組大鼠子宮指數(shù)顯著降低（P＜0.05），而荔枝核低劑量組大鼠子宮指數(shù)也呈減小趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）。荔枝核提取物對模型大鼠子宮指數(shù)的影響見表5。

表5 荔枝核提取物對模型大鼠子宮指數(shù)的影響（，n＝10）Tab 5 Effect of ESL on uterus index in HMG rats（，n＝10）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.mormal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組乳結(jié)平組荔枝核高劑量組荔枝核中劑量組荔枝核低劑量組子宮指數(shù)/g·100 g-1 0.24±0.400.52±0.12＊0.28±0.09##0.37±0.05#0.39±0.10#0.45±0.12劑量/g·kg-1--3.3442211

3 討論

隨著社會發(fā)展，社會競爭加大、心理壓力增加、膳食結(jié)構(gòu)不合理等因素使乳腺疾病發(fā)病率急劇增加。一直以來，HMG被認為與患者內(nèi)分泌紊亂、雌激素水平過高及乳腺局部組織對雌激素過于敏感有關(guān)。

Strange等[4]證明，雌二醇（E2）和孕酮（P）水平在大鼠的性周期產(chǎn)生變化，并調(diào)節(jié)乳腺上皮的增殖與凋亡。研究[5]表明，胰島素生長因子-1、表皮生長因子和性激素通過mTOR通路調(diào)節(jié)乳腺上皮細胞的自噬作用，使乳腺上皮細胞的增殖與凋亡達到動態(tài)平衡。ER和PR是一種蛋白質(zhì)，對E2和P具有高選擇性、高親和力并與其結(jié)合的生理功能特點。當E2升高時，促使正常上皮細胞增殖，致使乳腺增生的發(fā)生；另一方面，抑制細胞免疫，使乳腺組織自身修復能力降低，增生的上皮細胞通過激素受體系統(tǒng)使ER合成增加，隨之代表ER活性的PR亦增多，隨著ER和PR合成的增多，E2進一步刺激引起乳腺上皮細胞的增生和細胞功能活躍。性激素受體ER和PR的檢測結(jié)果說明了HMG與ER和PR的相關(guān)性，顯示乳腺良性病變中存在ER和PR，且表達較高。HMG隨著增生程度的加重，其ER和PR有顯著增加的趨勢。當大鼠乳腺組織形態(tài)表現(xiàn)為顯著增生時，乳腺ER和PR病理積分也顯著升高。黃勤等[6]研究表明，雌激素受體顯著增多，對雌激素感受性增加，可導致HMG甚至癌變。

本研究結(jié)果表明，大鼠經(jīng)im苯甲酸雌二醇出現(xiàn)乳腺小葉、腺泡上皮增生、導管擴張、間質(zhì)水腫等病理性改變；后期施用孕酮，進一步促進腺泡發(fā)育。說明外源性性激素的異常刺激可造成大鼠乳腺組織的病理性增生，其改變與人體HMG病理類似，成功模擬HMG病理模型。對HMG大鼠乳腺組織ER和PR表達及細胞凋亡、子宮指數(shù)的觀察，與正常組比較，模型大鼠乳腺組織ER和PR表達顯著增強，乳腺組織出現(xiàn)的凋亡細胞較少，子宮指數(shù)顯著增高；荔枝核3個劑量組均可使模型大鼠乳腺組織ER和PR表達顯著降低，乳腺組織出現(xiàn)較高的凋亡細胞或死亡細胞，子宮指數(shù)顯著減少。由此推測，HMG的發(fā)病除了過高的E2直接刺激或P值降低不能保護乳腺組織的作用外，乳腺組織中ER和PR含量增加使組織對性激素的敏感性增強也是此病發(fā)生的另一重要因素。

HMG屬中醫(yī)“乳癖”、“乳痞”、“乳中結(jié)核”等范疇，臨床以乳房疼痛、腫塊隨月經(jīng)周期變化為主要特點。病因病機多與情志不調(diào)、肝氣郁結(jié)有關(guān)，在辨證分型上常分為肝郁氣滯、沖任失調(diào)、痰凝血瘀等型。荔枝核具有活血化瘀、軟堅散結(jié)等功效，在臨床上用于治療HMG取得良好的療效。本研究表明，荔枝核能不同程度地抑制乳腺組織ER和PR表達，并促進乳腺組織細胞凋亡，改善HMG及子宮的病理變化，從而有效地抑制HMG，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌。

參考文獻

[1]潘競鏘，郭潔文，韓 超，等，荔枝核的藥理實驗研究[J].中國新藥雜志，2000，9（1）：14.

[2]林 妮，肖柳英，呂俊華，等.荔枝核提取物抑制大鼠乳腺增生及調(diào)節(jié)激素水平研究[J].中國臨床藥理學與治療學雜志，2009，14（8）：861.

[3]洪素蘭，蘆 錳，張翠英，等.肝舒樂片對乳腺增生病大鼠性激素受體的影響[J].中醫(yī)研究，2007，20（4）：12.

[4]Strange R，Westerlind KC，Ziemiecki A，et al.Proliferation and apoptosis in mammary epithelium during the rat oestrous cycle[J].Acta Physiol（Oxf），2007，190（2）：137.

[5]Sobolewska A，Gajewska M，Zarzyńska J，et al.IGF-I，EGF，and sex steroids regulate autophagy in bovine mammary epithelial cells via the mTOR pathway[J].Eur J Cell Biol，2009，88（2）：117.

[6]黃 勤，孟凡青.粗針穿刺活檢乳腺非惡性增生病變的病理診斷[J].診斷病理學，2005，12（1）：70.