盧仁福，賈 科，侯朋遠(yuǎn)，吳慶琛(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸心外科，重慶市 400016）

生姜為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc的新鮮根莖，既是食品又是臨床廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)中藥，其性味辛溫，具有解表散寒、溫中止嘔、行水解毒、化痰止咳之功效[1]。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，生姜除具有抗血小板聚集、降低血脂和擴(kuò)張血管、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用外，還具有抗缺氧、抗氧化作用，對(duì)人心肌細(xì)胞缺氧缺糖性損傷有保護(hù)作用[2～3]。研究表明[4～6]，在家兔急性完全性腦缺血再灌注模型中，生姜提取液有抗急性腦缺血再灌注損傷作用。而生姜醇提取物在心臟缺血再灌注的研究，國(guó)內(nèi)、外還未曾報(bào)道。本研究旨在探討生姜醇提取物對(duì)在體結(jié)扎大鼠抗急性局部心肌缺血再灌注損傷的作用及可能的作用機(jī)制，為生姜預(yù)處理在體外循環(huán)心臟手術(shù)中和冠心病急性心肌梗死有效恢復(fù)心肌血液灌注后心肌保護(hù)的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

DH-140型動(dòng)物人工呼吸機(jī)（浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠）；3K30型高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；DK-8D型電熱恒溫水箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)有限公司）；722型分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；BL-420E型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；600型透射電鏡（日本日立公司）。

1.2 試藥

生姜醇提取物（西安天一生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：TYG060326）；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠50只，鼠齡11周，♀，體質(zhì)量250～300 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（渝）2007-0001）。

2 方法

2.1 模型的復(fù)制

大鼠稱重，ip 10%烏拉坦（6 mL·kg-1）麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)。頸部去毛，切開皮膚，分離頸前肌，暴露氣管，氣管切開后插管（由一次性塑料滴管制作），接動(dòng)物人工呼吸機(jī)行機(jī)械通氣（潮氣量40 mL·kg-1，吸氣∶呼氣＝1∶1.5），于呼氣末持續(xù)正壓通氣。雙前肢及右后肢接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，電腦全程實(shí)時(shí)記錄心電圖變化。胸骨旁行一0.7 cm切口開胸，暴露心臟，左心耳和肺動(dòng)脈圓錐間找到與左冠狀動(dòng)脈伴行的冠狀靜脈，在左心耳下方2 mm處以5～0無損傷縫合針穿線，進(jìn)針深度為1.0～1.5 mm，寬度為2～3 mm，用一細(xì)小硅膠管墊于血管和結(jié)扎線之間結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，缺血再灌注方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)[7]，即結(jié)扎后結(jié)扎線下方心肌顏色變紫紺、5～15 min心電圖顯示T波高聳或倒置為結(jié)扎成功；再灌注時(shí)松開結(jié)扎線，心肌顏色逐漸恢復(fù)紅潤(rùn)為再灌注成功。

2.2 分組及給藥

將SD大鼠隨機(jī)分成5組，即假手術(shù)（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）及生姜醇提取物高、中、低劑量（400、300、200 mg·kg-1）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)6周。最后一天ig后1 h開始復(fù)制模型，其中模型及生姜醇提取物高、中、低劑量組大鼠均行左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎缺血30 min，再灌注90 min；假手術(shù)組只行左冠狀動(dòng)脈前降支穿線，但不結(jié)扎。

2.3 指標(biāo)的測(cè)定

再灌注實(shí)驗(yàn)結(jié)束后迅速剪下心臟，生理鹽水反復(fù)沖洗血跡后剪下左室前壁梗死部位，固定位置一部分心肌做透射電鏡，余固定位置的一部分心肌置液氮貯藏。

2.3.1 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢查：心肌組織離體后1～2 min內(nèi)，取左室前壁梗死部相同心肌部位4～5塊（組織大小1 mm3），放入3%戊二醛中固定，經(jīng)脫水、包埋、超薄切片，染色后做透射電鏡檢查。

2.3.2 心肌組織勻漿MDA含量測(cè)定：準(zhǔn)確稱取心肌組織，按質(zhì)量體積比加9倍生理鹽水，在低溫冰水下用玻璃研磨器研磨制成10%心肌組織勻漿，離心，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定心肌組織勻漿MDA含量。

2.3.3 心肌組織勻漿SOD活性測(cè)定：準(zhǔn)確稱取心肌組織，按質(zhì)量體積比加99倍生理鹽水，制成1%心肌組織勻漿，離心，取上清液，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定心肌組織勻漿SOD活性。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢查

假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞膜基本完整，線粒體膜基本完整；模型組大鼠心肌細(xì)胞破壞嚴(yán)重，呈壞死性改變，線粒體分布紊亂腫脹，膜破裂，Z線不清，排列紊亂、模糊不清，線粒體中重度溶解，甚至大片空泡化；生姜醇提取物高、中、低劑量組大鼠心肌損傷程度較模型組明顯改善，肌原纖維排列基本整齊規(guī)則，肌絲稀疏，少數(shù)線粒體輕度腫脹。透射電鏡下大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)見圖1。

3.2 心肌組織勻漿MDA含量、SOD活性的測(cè)定

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織MDA含量顯著升高（P＜0.01），SOD活性則顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，生姜醇提取物高、中、低劑量組大鼠心肌組織MDA含量顯著降低（P＜0.01），而SOD活性顯著升高（P＜0.01），隨著生姜醇提取物劑量增加，無劑量依賴現(xiàn)象。生姜醇提取物對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后MDA含量、SOD活性的影響見表1。

圖1 透射電鏡下大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)A.假手術(shù)組；B.模型組；C.生姜醇提取物低劑量組；D.生姜醇提取物中劑量組；E.生姜醇提取物高劑量組Fig 1 Ultrastructure of myocardial cells under TEMA.sham group；B.model group；C.low-dose ethanol extract of Z.officinale group；D.medium-dose ethanol extract of Z.officinale group；E.high-dose ethanol extract of Z.officinale group

表1 生姜醇提取物對(duì)模型大鼠心肌缺血再灌注后MDA含量、SOD活性的影響（，n＝10）Tab 1 Effects of ethanol extract of Z.officinale on the content of MDA and activity of SOD in myocardial ischemia-reperfusion rats（，n＝10）

表1 生姜醇提取物對(duì)模型大鼠心肌缺血再灌注后MDA含量、SOD活性的影響（，n＝10）Tab 1 Effects of ethanol extract of Z.officinale on the content of MDA and activity of SOD in myocardial ischemia-reperfusion rats（，n＝10）

與假手術(shù)組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.sham group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

4 討論

心肌缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為主要與氧自由基的產(chǎn)生、生物膜脂質(zhì)過氧化、鈣超載等相關(guān)[8～13]。在正常情況下，氧自由基（OFR）可以被內(nèi)源性自由基清除劑如SOD、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）等清除，使得細(xì)胞免受氧自由基的毒性損傷。心肌缺血再灌注后，機(jī)體主要通過黃嘌呤氧化酶途徑產(chǎn)生大量氧自由基，主要以羥自由基（OH-）的形式通過攻擊膜組分磷脂中的不飽和脂肪酸，引發(fā)一系列自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，生成多種脂質(zhì)過氧化物，并引起細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷，從而進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的一系列損害。MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量不僅反映了脂質(zhì)過氧化程度，也間接反映體內(nèi)氧自由基的代謝狀況和機(jī)體細(xì)胞受自由基損害的程度[14]。SOD作為體內(nèi)清除氧自由基重要的酶之一，其活性高低反映了清除氧自由基的能力。本研究中生姜醇提取物高、中、低劑量組大鼠心肌組織MDA含量顯著降低（P＜0.01），SOD活性顯著升高（P＜0.01），提示生姜醇提取物能降低心肌缺血再灌注損傷后的脂質(zhì)過氧化程度，增強(qiáng)清除氧自由基能力，從而減輕心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損害，且隨著生姜醇劑量的增加，無劑量依賴關(guān)系。

心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變是反映細(xì)胞損傷最直觀的指標(biāo)[15]。線粒體是細(xì)胞清除氧自由基、進(jìn)行呼吸作用和能量轉(zhuǎn)換的重要場(chǎng)所，其提供的能量是細(xì)胞生命活動(dòng)的保證，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性是反映心肌損傷的敏感指標(biāo)[16]。同時(shí)，線粒體是決定細(xì)胞損傷程度及顯示損傷能否可逆的關(guān)鍵細(xì)胞器，也是清除破壞力極大的氧自由基酶系統(tǒng)活力最重要的部位，具有維持活體細(xì)胞生化氧化和能量產(chǎn)生的重要功能。本研究中心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示，生姜醇提取物高、中、低劑量組心肌損傷程度較模型組顯著改善，線粒體破壞較小，說明生姜醇提取物可有效保護(hù)線粒體，從而增加清除氧自由基的場(chǎng)所和能量，增強(qiáng)清除氧自由基的能力，減輕脂質(zhì)過氧化的程度，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞。

生姜醇提取物為生姜經(jīng)乙醇提取后的主要物質(zhì)，主要為姜辣素，可分為姜酚類、姜烯酚類、姜酮類、姜二酮類和姜二醇類等不同類型，具有散寒解表、溫中止吐、回陽(yáng)通脈、燥濕消痰等功效。姜酚類、姜烯酚類、姜酮類、姜二酮類等業(yè)已證明有抗缺氧、抗清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化等多種藥理作用。研究表明[5，17]，生姜醇提取物在肝臟、腦的急性缺血再灌注損傷中具有保護(hù)作用。本研究中，生姜醇提取物降低了缺血再灌注后的脂質(zhì)過氧化程度，增強(qiáng)了清除氧自由基的能力，心肌超微結(jié)構(gòu)顯示生姜醇提物高、中、低組心肌細(xì)胞和線粒體破壞較小，減輕了缺血再灌注對(duì)心肌細(xì)胞及線粒體的損害，從而有效地保護(hù)了心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。本研究結(jié)果證實(shí)了生姜醇提取物在心肌缺血再灌注損傷中具有保護(hù)作用。其可能的作用機(jī)制是通過保護(hù)線粒體，增加清除氧自由基的場(chǎng)所和能量，增強(qiáng)清除氧自由基的能力，減輕脂質(zhì)過氧化的程度，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。

[1]黃泰康.常用中藥成分與藥理手冊(cè)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1994：178.

[2]劉雪梅.生姜的藥理作用研究進(jìn)展[J].中成藥，2002，24（7）：539.

[3]王 橋，宋學(xué)英，朱 瑩，等.生姜醇提取物抗氧化及抗缺氧作用的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2003，28（6）：551.

[4]何麗婭，吳和平，黃崇新，等.生姜對(duì)腦缺血再灌注損傷防治作用的探討[J].現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1995，12（5）：3.

[5]何麗婭，吳和平，劉金雄，等.生姜對(duì)家兔實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注損傷的復(fù)蘇療效研究[J].實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，9（3）：155.

[6]何麗婭，黃崇新，李松平.生姜對(duì)缺血性腦損傷時(shí)過氧化氫酶、Ca2+-ATP酶活性及乳酸含量的影響[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，1999，12（1）：7.

[7]W olfrum S，Richardt G ，Dominiak P，et al.A pstatin a selective inhibitor of aminopeptidase P，reduces myocardial infarct size by a kinin-dependent pathway[J].Br J Pharmacol，2001，134（2）：370.

[8]Kim YM，Ha YM，Jin YC，et al.Palmatine from Coptidis rhizoma reduces ischemia-reperfusion-mediated acute myocardial injury in the rat[J].Food Chem Toxicol，2009，47（8）：2097.

[9]Ke ZP，Wang JN，Tang JM，et al.The role of PEP-1-SOD1fusion protein on ischemia-reperfusion injury in isolated perfused rat hearts[J].Zhonghua Xinxueguan Bing Zazhi，2009，37（3）：268.

[10]Koini EN，Papazafiri P，Vassilopoulos A，et al.5，7，8-Trimethyl-benzopyran and 5，7，8-trimethyl-1，4-benzoxazine aminoamide derivatives as novel antiarrhythmics against ischemia-reperfusion injury[J].J Med Chem，2009，52（8）：2328.

[11]Rao PR，Viswanath RK.Cardioprotective activity of silymarin in ischemia-reperfusion-induced myocardial infarction in albino rats[J].Exp Clin Cardiol，2009，12（4）：179.

[12]Kubavat JB，Asdaq SM.Role of Sida cordifolia L.leaves on biochemical and antioxidant profile during myocardial injury[J].J Ethnopharmaco，2009，124（1）：162.

[13]Parlakpinar H，Olmez E，Acet A，et al.Beneficial effects of apricot-feeding on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats[J].Food Chem Toxicol，2009，47（4）：802.

[14]馬 云，肖 煒，侯連兵.腎衰寧分散片對(duì)慢性腎衰竭模型大鼠血清NO、NOS、SOD和MDA水平的影響研究[J].中國(guó)藥房，2008，19（24）：1853.

[15]武忠弼.超微病理學(xué)基礎(chǔ)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1990：113.

[16]Schneider R，Welt K，Aust W，et al.Cardiac ischemia and reperfusion in spontaneously diabetic rats with and without application of EGb 761：II.Interstitium and microvasculature[J].Histol Histopathol，2009，24（5）：587.

[17]鄧立明，彭成江，齊 波，等.生姜醇提取物對(duì)家兔肝臟缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用[J].大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，10（7）：10.