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依達(dá)拉奉對(duì)腦出血大鼠血腫周?chē)M織細(xì)胞凋亡及P38MAPK蛋白表達(dá)的影響

2010-05-22 03:08趙紫燁李建民張晉霞華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科唐山市063000
中國(guó)藥房 2010年13期
關(guān)鍵詞:組織細(xì)胞達(dá)拉陽(yáng)性細(xì)胞

劉 斌,趙紫燁,李建民,周 云,張晉霞(華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科,唐山市 063000)

腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)后腦損傷不僅是由于血腫的占位效應(yīng)及血腫對(duì)周?chē)X組織的直接破壞,繼發(fā)性腦損傷也是出血后腦損傷的主要原因。細(xì)胞凋亡在腦出血繼發(fā)性腦損傷中起重要作用[1]。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases,MAPK)是細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是一類(lèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。P38MAPK信號(hào)途徑是MAPK家族中的重要組成部分:P38MAPK通過(guò)多級(jí)激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)把細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞,傳遞至細(xì)胞核中,激活下游的激酶或多種轉(zhuǎn)錄因子從而介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生各種反應(yīng)[2],在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[3]。依達(dá)拉奉是一種新型自由基清除劑,能夠清除腦梗死周?chē)毖氚祹Яu自由基,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化,從而抑制腦細(xì)胞的損傷和凋亡。依達(dá)拉奉對(duì)腦梗死的治療有一定的療效[4],但對(duì)腦出血后血腫周?chē)M織細(xì)胞凋亡及P38MAPK蛋白表達(dá)變化的影響還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腦出血模型,觀察依達(dá)拉奉對(duì)腦出血大鼠血腫周?chē)M織細(xì)胞凋亡及P38MAPK蛋白表達(dá)的影響,探討依達(dá)拉奉對(duì)腦出血后腦細(xì)胞的保護(hù)作用,為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康♂Wistar大鼠108只,體質(zhì)量260~301 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號(hào):SCXK(京)-2007-0001。

1.2 試藥

Ⅶ型膠原酶(美國(guó)Sigma公司,規(guī)格:1.5 kIU);原位凋亡(TUNEL)試劑盒(福建邁新生物技術(shù)有限公司);SP試劑盒、P38MARK多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);依達(dá)拉奉注射液(南京先聲藥業(yè)公司提供,批號(hào):040181,規(guī)格:10 mg·5 mL-1)。

2 方法

2.1 分組

取大鼠108只,隨機(jī)分為腦出血組(48只)、依達(dá)拉奉治療組(48只)、假手術(shù)組(6只)、正常對(duì)照組(6只)。腦出血組與依達(dá)拉奉治療組再根據(jù)血腫制成后斷頭取腦的時(shí)間各分為3、6、12 h,1、2、3、5、7 d(時(shí)間點(diǎn)的選取依據(jù)腦出血的病理變化特點(diǎn))共8個(gè)亞組,每組6只。

2.2 大鼠腦出血模型制作

術(shù)前大鼠12 h禁食,4 h禁水,以100 g·L-1水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉,保證手術(shù)期間大鼠有自主呼吸。然后參照Rosenberg等[4]的方法,根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》[5],將膠原酶(在生理pH和溫度下,該化合物具有水解天然膠原蛋白的作用)注入到大鼠蒼白球誘導(dǎo)腦出血模型。確定蒼白球位置為前囟后1.4 mm,中線向右旁3.2 mm,深度為5.6 mm。腦出血組及依達(dá)拉奉治療組向蒼白球緩慢注入2 μL含0.4 IUⅦ型膠原酶的生理鹽水,假手術(shù)組注入2 μL滅菌生理鹽水,4 min注射完畢,留針5 min后緩慢將針退出,骨蠟封閉顱骨鉆孔,縫合皮膚。正常對(duì)照組不作任何處理。

2.3 給藥方法

依達(dá)拉奉治療組于腦出血后2 h腹腔內(nèi)注射依達(dá)拉奉3 mg·kg-1(取量依據(jù):根據(jù)依達(dá)拉奉使用說(shuō)明書(shū)及文獻(xiàn)報(bào)道確定[6]),每天1次,用藥到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。假手術(shù)組和腦出血組給與等量生理鹽水。

2.4 組織切片制備

在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)麻醉大鼠,以生理鹽水和4%多聚甲醛灌注固定后斷頭取腦,以血腫為中心按冠狀位切取血腫周?chē)? mm的腦組織,置于上述灌注液中固定24 h以上。常規(guī)石蠟包埋腦組織,分別做5 μm連續(xù)切片備用。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用TUNEL法。具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn):光鏡下細(xì)胞核呈棕黃色者為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞。

2.6 P38MAPK蛋白檢測(cè)

采用免疫組化SP法,具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn):光鏡下P38MAPK蛋白以細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色著色為陽(yáng)性細(xì)胞。

2.7 圖像分析

高倍鏡下隨機(jī)觀察腦出血血腫周?chē)X組織不重疊的6個(gè)視野,采用高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)TUNEL檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)和P38MAPK免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),取其平均值為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以Excel數(shù)據(jù)庫(kù)整理后用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,2組間同一時(shí)間點(diǎn)的比較采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn),同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用方差分析,兩指標(biāo)間相關(guān)性用簡(jiǎn)單相關(guān)及直線回歸分析,以P<0.05為差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

正常對(duì)照組未見(jiàn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞,假手術(shù)組術(shù)后48 h僅于針道周?chē)家?jiàn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞,因數(shù)量極少故未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。腦出血組和依達(dá)拉奉治療組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠血腫周?chē)M織細(xì)胞凋亡數(shù)比較(個(gè),,n=6)Tab1 Comparison of amount of apoptotic cells in perihematoma region of rats between two groups at different time points(piece,,n=6)

表1 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠血腫周?chē)M織細(xì)胞凋亡數(shù)比較(個(gè),,n=6)Tab1 Comparison of amount of apoptotic cells in perihematoma region of rats between two groups at different time points(piece,,n=6)

注:方差分析,腦出血組F=486.928,P<0.01;依達(dá)拉奉治療組F=312.908,P<0.01;同組內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)比較:△P<0.01;依達(dá)拉奉治療組與同時(shí)間點(diǎn)腦出血組比較:▲P<0.01note:variance analysis:in ICH group F=486.928,P<0.01;in edaravone treatment group F=312.908,P<0.01;the former time point vs.the later time point in the same group:△P<0.01;edaravone treatment group vs.ICH group at the same time point:▲P<0.01

由表1可見(jiàn),腦出血組大鼠腦出血3 h后腦出血灶周已出現(xiàn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞,出血后6 h開(kāi)始明顯增加,于出血后2~3 d達(dá)到高峰,到出血后3 d凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量開(kāi)始下降。依達(dá)拉奉治療組大鼠腦出血后3 h也可見(jiàn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞,并隨腦出血時(shí)間延長(zhǎng)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增加,于腦出血后2~3 d達(dá)到高峰,3 d后開(kāi)始下降。與腦出血組相比,依達(dá)拉奉治療組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞于腦出血后3 h未見(jiàn)明顯降低(P>0.05),于腦出血后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d 數(shù)量均有降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.2 P38MAPK蛋白檢測(cè)結(jié)果

正常對(duì)照組及假手術(shù)組均可見(jiàn)少量P38MAPK蛋白表達(dá)。腦出血組和依達(dá)拉奉治療組不同時(shí)間點(diǎn)P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn),大鼠腦出血后3 h出血腫周?chē)鷧^(qū)P38MAPK蛋白陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始增加,其分布區(qū)域與凋亡細(xì)胞相同,包括膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及部分血管內(nèi)皮細(xì)胞。隨腦出血時(shí)間延長(zhǎng),P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸增加,腦出血后6 h開(kāi)始明顯增加,于腦出血后12 h~1 d達(dá)高峰,之后開(kāi)始逐漸下降。依達(dá)拉奉治療組大鼠腦出血后3 h也可見(jiàn)P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始增加,并隨出血時(shí)間延長(zhǎng)P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多,于出血后12 h~1 d達(dá)到高峰,之后開(kāi)始逐漸下降。與腦出血組相比,依達(dá)拉奉治療組P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞于出血后3 h未見(jiàn)明顯降低(P>0.05),于腦出血后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d數(shù)量均有降低,且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

表2 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠血腫周?chē)M織P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè),,n=6)Tab 2 Comparison of amount of P38MAPK positive cells in perihematoma region of rats between two groups at different time points(piece,,n=6)

表2 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠血腫周?chē)M織P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè),,n=6)Tab 2 Comparison of amount of P38MAPK positive cells in perihematoma region of rats between two groups at different time points(piece,,n=6)

注:方差分析,腦出血組F=367.194,P<0.01;依達(dá)拉奉治療組F=246.744,P<0.01;同組內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)比較:△P<0.01;依達(dá)拉奉治療組與同時(shí)間點(diǎn)腦出血組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01note:variance analysis:in ICH group F=367.194,P<0.01;in edaravone treatment group F=246.744,P<0.01;the former time point vs.the later time point in the same group:△P<0.01;edaravone treatment group vs.ICH group at the same time point:▲P<0.05,▲▲P<0.01

時(shí)間3 h 6 h 12 h 1 d 2 d 3 d 5 d 7 d依達(dá)拉奉治療組33.56±2.3643.09±2.81▲△49.13±3.40▲▲△59.69±3.03▲▲△51.27±3.71▲▲△44.67±3.13▲▲△38.37±2.85▲▲△32.93±2.63▲▲△腦出血組34.16±2.2747.31±2.68△55.92±3.32△68.43±3.97△59.04±3.44△52.92±2.91△46.52±2.64△41.16±2.51△

4 討論

依達(dá)拉奉是目前臨床試驗(yàn)證明唯一有效的自由基清除劑[7]。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮,相對(duì)分子量為174.20,是一種具有親脂性基團(tuán)的化合物,在體內(nèi)以陰離子形式存在,并可轉(zhuǎn)移1個(gè)電子給自由基而產(chǎn)生依達(dá)拉奉基團(tuán),阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)鏈,進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[8]。筆者的研究結(jié)果顯示,腦出血后血腫周?chē)M織存在細(xì)胞凋亡;與腦出血組相比,依達(dá)拉奉治療組于腦出血后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d及7 d血腫周?chē)M織細(xì)胞凋亡表達(dá)均減少。表明依達(dá)拉奉可抑制腦出血后血腫周?chē)M織的細(xì)胞凋亡,對(duì)出血后腦組織起到神經(jīng)保護(hù)作用。

研究[9]發(fā)現(xiàn),P38MAPK信號(hào)通路參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及細(xì)胞間功能同步等多種生理過(guò)程,并與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)。筆者在本實(shí)驗(yàn)中觀察到,大鼠腦出血后3 h即可見(jiàn)P38MAPK蛋白的表達(dá),表達(dá)高峰出現(xiàn)在腦出血后1 d,于2 d后開(kāi)始下降,而正常對(duì)照組和假手術(shù)組P38MAPK蛋白均為低表達(dá)。與腦出血組相比,依達(dá)拉奉治療組p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞于出血后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d及7 d數(shù)量均有降低。說(shuō)明依達(dá)拉奉治療組與腦出血組之間在P38MAPK蛋白的表達(dá)上存在明顯的變化差異,依達(dá)拉奉降低了P38MAPK蛋白的表達(dá),說(shuō)明依達(dá)拉奉能抑制P38MAPK蛋白的表達(dá)。

筆者還發(fā)現(xiàn),P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于腦出血血腫周?chē)軗p傷的膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元,與凋亡細(xì)胞分布區(qū)域一致,且依達(dá)拉奉能抑制P38MAPK蛋白的表達(dá)與抑制腦出血后血腫周?chē)M織的細(xì)胞凋亡的表達(dá)結(jié)果是一致的。因此,本研究結(jié)果表明,依達(dá)拉奉抑制細(xì)胞凋亡可能通過(guò)下調(diào)促凋亡相關(guān)P38MAPK蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的,但其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

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