翟永貞，周言，馬力，馮國和

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院感染科，沈陽 110004）

流行性乙型腦炎 （Japanese encephalitis，JE）DNA疫苗的免疫效果已經(jīng)得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)，編碼流行性乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）各種結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白基因重組子能夠提供不同程度的保護(hù)性免疫，免于JEV病毒攻擊［1］；通過比較上述重組質(zhì)粒在分別免疫動物后所產(chǎn)生的中和抗體效價與保護(hù)性免疫效果，發(fā)現(xiàn)將前膜（prM）蛋白與包膜（E）蛋白編碼基因聯(lián)合構(gòu)建于同一表達(dá)載體所產(chǎn)生的免疫效果明顯優(yōu)于單純含E蛋白編碼基因重組子［2］。然而同現(xiàn)有JE滅活或減毒活疫苗免疫效果比較，DNA疫苗誘導(dǎo)的中和抗體產(chǎn)生時間、抗體效價增長速度［3］、效價絕對值還達(dá)不到預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)［4］。JEDNA疫苗增強(qiáng)效應(yīng)的研究已越來越受到人們的重視。

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF） 編碼基因已經(jīng)被應(yīng)運(yùn)于JE DNA疫苗增強(qiáng)效應(yīng)的研究，研究證實(shí)GM-CSF編碼基因重組子能夠增加抗JEV總抗體以及中和抗體效價，提高免疫動物生存率［5］。目前國內(nèi)外尚未研究報(bào)道有關(guān)JEDNA疫苗與GM-CSF編碼基因的融合構(gòu)建與表達(dá)。本項(xiàng)研究構(gòu)建JEV prME蛋白與BALB/c鼠GM-CSF編碼基因真核重組表達(dá)載體，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染中華倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞并建立融合蛋白穩(wěn)定表達(dá)株，為JEDNA疫苗增強(qiáng)效應(yīng)的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法方法部分要刪減

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞及主要試劑

含JEV prME蛋白編碼基因重組質(zhì)粒被命名為pJME，由感染科實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建［6］，所選真核表達(dá)載體為pcDNA3，在BamH I與EcoR I酶切位點(diǎn)間插有JEV prME蛋白編碼基因。原核表達(dá)載體pMD19-T simple［Code No.D104C］購自Takara公司，用于BALB/c鼠GM-CSF編碼基因測序。真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）購自 Invitrogen公司，用于 JEV prME蛋白與GM-CSF編碼基因的融合構(gòu)建。CHO細(xì)胞購自中國科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫，生長于37℃，5%CO2及含 10%胎牛血清（fatal calf serum，F(xiàn)CS）的 Dulbecos modified eagle medium（D-MEM）中，脂質(zhì)體（Lipofectamine2000）購自Invitrogen公司，分別用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中受體細(xì)胞及轉(zhuǎn)染試劑。大腸桿菌JM109與DH5α，限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamH I以及Not I等均購自Takara公司，用于重組質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及酶切鑒定。新霉素類似物（G418）購自GiBCO公司，用于CHO細(xì)胞抗性克隆株的篩選。山羊抗鼠GMCSF購自Santa公司，辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG購自北京中山公司，電致化學(xué)發(fā)光（electrogenerated chemiluminescence，ECL） 檢測試劑購自 Pierce公司，用于重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Western-blot分析。

1.2 BALB/c鼠GM-CSF編碼基因的重組構(gòu)建

從BALB/c鼠脾臟獲取細(xì)胞總RNA，采用套式-RT-PCR法擴(kuò)增GM-CSFCDS區(qū)域序列（426 bp）。反轉(zhuǎn) 錄 引 物 ：5′-CAGGCACAAAAGCAGCAGTC-3′；PCR外引物：上游引物為5′-CAGAGAGAAAGGCTAAGGTC-3′，下游引物為上述反轉(zhuǎn)錄引物；PCR內(nèi)引物：上游引物為 5′-GAATTCGGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGTGGTTCAGGAGGAGGTGGATC GATGTGGCTGCAGAATTTAC-3′，下游引物為 5′-GCGGCCGCTCATTTTTGGCCTGGTTTTTTG-3′，用于PCR內(nèi)引物的上游引物和下游引物的5’端分別引入EcoRI和Not I酶切位點(diǎn)，劃線部分為由15個氨基酸組成的Gly-Linker。使用DNA片斷純化試劑盒（Takara，product No.DV807） 與 DNA A 尾試劑盒（Takara，product No.D404）分別對擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行純化及“A”處理，使用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（Takara，product No.DV805）進(jìn)行切膠回收DNA，按照DNA連接試劑盒（Takara，product No.D6023）說明書要求，后者與pMD19-Tsimple連接構(gòu)建重組子pMD-GM-CSF，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌JM109。質(zhì)粒小劑量提取試劑盒（Takara，product No.DV801A）提取重組質(zhì)粒并經(jīng)EcoRI/Not I進(jìn)行酶切鑒定，采用ABIPRSMTM310Genetic Analyzer（Pekin-Elmer/Applied）及引物Bca BESTPrimer M13-47對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。將測序正確的目的基因經(jīng)EcoR I/Not I雙酶切并亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+），將此重組子命名為pGM-CSF。

1.3 JEV prME蛋白與BALB/c鼠GM-CSF編碼基因的融合構(gòu)建

使用限制性內(nèi)切酶BamH I/EcoR I對質(zhì)粒pGM-CSF、pJME進(jìn)行雙酶切，將獲取的JEV prME蛋白編碼基因亞克隆至pGM-CSF的BamH I/EcoRI酶切位點(diǎn)之間，含有JEV prME蛋白與BALB/c鼠GM-CSF編碼基因的重組子被命名為pJME/GMCSF。轉(zhuǎn)化pJME/GM-CSF于大腸桿菌DH5α并經(jīng)篩選后，分別經(jīng)BamH I/EcoRI，BamH I/Not I酶切以及1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 pJME/GM-CSF轉(zhuǎn)染及CHO細(xì)胞抗性克隆株篩選

確定本實(shí)驗(yàn)最佳G418濃度篩選：將常規(guī)培養(yǎng)的CHO細(xì)胞（1 000個/mL）加入24孔板（0.7 mL/每孔）孵育，6 h后每孔分別加入不同濃度的G418，依次為 600 mg/L，650 mg/L，700 mg/L，750 mg/L，800 mg/L，850 mg/L，900 mg/L，每種濃度設(shè) 3 個孔，余下3孔為正常細(xì)胞對照。培養(yǎng)11d后確定能殺死所有細(xì)胞的最低G418濃度作為本實(shí)驗(yàn)的最佳篩選濃度，即為800 mg/L。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pJME/GM-CSF于CHO 細(xì)胞［6］，24 h 后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞按 1∶10傳代，48 h后更換為含800 mg/L G418的D-MEM進(jìn)行篩選，7 d后將G418濃度降為400 mg/L維持培養(yǎng)。

1.5 Western-blot分析

參照參考文獻(xiàn)［7］并加以改進(jìn)，收集pJME/GMCSF轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液破碎細(xì)胞后收集總蛋白，12%SDS-PAGE凝膠電泳完畢后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，加入山羊抗鼠GM-CSF多克隆抗體（1∶200稀釋），4℃過夜，TBST洗滌10 min×3次，加入HRP標(biāo)記的兔抗山羊的二抗（1∶50 000稀釋），室溫2 h，TBST洗滌10 min×3次，加入ECL試劑，顯影、定影。方法部分內(nèi)容太細(xì)，常規(guī)方法寫明名稱就可，不用詳細(xì)介紹步驟。盡量節(jié)省版面。

2 結(jié)果

2.1 pJME/GM-CSF的重組構(gòu)建

套式-RT-PCR法獲得的GM-CSF編碼基因經(jīng)測序分析與發(fā)表的GM-CSFCDS區(qū)域序列相符合。將處理后的GM-CSF基因插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）EcoR I/Not I酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組子pGM-CSF（圖1）。pJME中JEV prME蛋白編碼基因插入pGMCSF BamH I/EcoR I酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組子pJME/GM-CSF（圖 1，圖 2 lane1）。pJME/GM-CSF 經(jīng) BamH I/EcoR I酶切釋出插入子與prME蛋白編碼基因片段（2 001 bp）大小相符（圖 2 lane2），pJME/GM-CSF經(jīng)BamH I/Not I酶切釋出的插入子片段約為2 472 bp（圖 2 lane3），為鼠 GM-CSF與 JEV prME蛋白編碼基因大小之和。

2.2 G418篩選過程中pJME/GM-CSF轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞抗性克隆株的演變

G418最適篩選濃度為800 mg/L。將轉(zhuǎn)染pJME/GM-CSF的CHO細(xì)胞加壓篩選（800 mg/L G418）7 d，培養(yǎng)板中可見小細(xì)胞團(tuán)簇形成，G418濃度減半（400 mg/L）維持培養(yǎng)26 d，普通光鏡檢查顯示小細(xì)胞團(tuán)簇逐步增大，細(xì)胞團(tuán)簇之間逐漸融合（圖3）。

2.3 pJME/GM-CSF轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的Wester blot分析

將pJME/GM-CSF轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞裂解并收集蛋白進(jìn)行Western blot分析，在Mr為85×103區(qū)域內(nèi)可見一特異性蛋白帶，空載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞未見相應(yīng)蛋白帶（圖4）。

3 討論

許多研究表明，細(xì)胞因子基因佐劑對DNA疫苗所致的免疫應(yīng)答有著重要的調(diào)節(jié)作用［8］。GM-CSF具有刺激樹突狀細(xì)胞分化與成熟、增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞表面MHC以及共刺激分子表達(dá)等免疫促進(jìn)功能，其編碼基因被作為DNA免疫佐劑并用于許多感染性疾病和腫瘤性疾病DNA疫苗增強(qiáng)效應(yīng)的研究［9］。通常采用三種方式將GM-CSF編碼基因作為免疫佐劑用于DNA疫苗增強(qiáng)效應(yīng)的研究，一種是將GMCSF編碼基因與目的抗原基因構(gòu)建于雙順反子真核表達(dá)載體；一種是分別將GM-CSF編碼基因和目的基因構(gòu)建于不同載體并共同注射動物模型，通過這種組合方式免疫，能夠篩選出具有較強(qiáng)免疫效應(yīng)的組合DNA疫苗；另一種是將GM-CSF編碼基因和目的基因融合表達(dá)于同一載體，編碼這種融合蛋白的DNA疫苗能夠改善抗原特異性免疫應(yīng)答和腫瘤性疾病的免疫治療。

本實(shí)驗(yàn)將JEV prME蛋白編碼基因與鼠GMCSF編碼基因（2 001 bp、426 bp）以定向克隆的方法分別插至真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+），構(gòu)建重組子pJME/GM-CSF，后者經(jīng)BamH I/EcoRI酶切釋出的插入子與pJME經(jīng)相同酶切釋出插入子的分子量大小相一致（圖2 lane2），從分子層面說明該重組子含有JEV prME蛋白編碼基因，又經(jīng)BamH I/Not I酶切釋出的插入子分子量約為2 472 bp（圖2 lane3），理論推算符合JEV prME蛋白編碼基因與鼠GM-CSF編碼基因的總和標(biāo)準(zhǔn)。DNA測序分析進(jìn)一步明確了兩個目的基因在真核表達(dá)載體中的正常連接，提示含JEV prME蛋白編碼基因與鼠GM-CSF編碼基因重組子pJME/GM-CSF構(gòu)建成功。

將轉(zhuǎn)染pJME/GM-CSF的CHO細(xì)胞加壓篩選（800 mg/L G418）7 d后，繼續(xù)以400 mg/L的G418維持培養(yǎng)，可見小細(xì)胞團(tuán)簇逐步增大，細(xì)胞團(tuán)簇之間逐漸融合（圖3），說明pJME/GM-CSF轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞抗性克隆株逐步形成。進(jìn)一步Western blot分析發(fā)現(xiàn)，pJME/GM-CSF轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞經(jīng)裂解電泳后，在大于Mr約72×103以上區(qū)域內(nèi)可檢測到一特異性蛋白帶，推算其Mr大小約85×103，進(jìn)而明確了融合蛋白分子量，通過對融合蛋白氨基酸數(shù)目（824AA）的理論推算，所檢測的融合蛋白分子量與理論計(jì)算相符合。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了JEV prME蛋白與鼠GM-CSF融合基因重組子，并建立CHO細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株，將為JEDNA疫苗增強(qiáng)效應(yīng)等研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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