謝蓮娜，曾定尹，張海山，孫丹萌，龐雪峰，關(guān)啟剛

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽(yáng) 110001）

動(dòng)脈壁由內(nèi)膜、中膜、外膜三層結(jié)構(gòu)組成。外膜為血管最外層結(jié)構(gòu)，由較厚的致密結(jié)構(gòu)組成，含有大量的膠原纖維和彈性纖維，細(xì)胞成分主要為成纖維細(xì)胞。越來(lái)越多的證據(jù)顯示外膜調(diào)節(jié)血管功能的作用遠(yuǎn)大于其作為血管壁支撐結(jié)構(gòu)的作用。Gonz觃lez等［1］發(fā)現(xiàn)去除血管外膜的大鼠頸動(dòng)脈及腸系膜動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素的收縮反應(yīng)明顯減弱；提示血管外膜能調(diào)節(jié)血管平滑肌的收縮功能，參與血管張力的調(diào)節(jié)。通過(guò)損傷血管外膜的方法建立早期動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用于研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理。動(dòng)脈粥樣硬化往往伴有血管收縮功能的改變，利用外膜參與血管張力調(diào)節(jié)的機(jī)制建立血管外膜損傷致血管痙攣的動(dòng)物模型有助于深入認(rèn)識(shí)外膜調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)血管功能的作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈外膜，觀察血管外膜損傷對(duì)血管收縮功能的影響，探討構(gòu)建血管外膜損傷介導(dǎo)血管收縮性增強(qiáng)的大鼠頸動(dòng)脈動(dòng)物模型的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12周清潔級(jí)雄性Wistar Kyoto大鼠30只，體質(zhì)量200~250 g（由吉林大學(xué)動(dòng)物室提供）。普通大鼠食料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈手術(shù)

手術(shù)在室溫下進(jìn)行。腹腔內(nèi)注射水合氯醛30 mg/kg麻醉大鼠，仰臥固定于自制鼠板上（40 cm×60 cm）。頸前脫毛后常規(guī)碘酊、乙醇消毒。沿正中線縱形切開(kāi)頸部皮膚，逐層鈍性分離頸部筋膜及肌肉，暴露右側(cè)頸動(dòng)脈鞘，仔細(xì)游離出右頸動(dòng)脈，長(zhǎng)約15~18 mm。用內(nèi)徑1.5 mm、長(zhǎng)12 mm的硅膠管縱向切開(kāi)后包裹于右頸動(dòng)脈外（包管側(cè)）；左側(cè)頸動(dòng)脈未處理，作為自身對(duì)照（對(duì)照側(cè)）。逐層縫合傷口，讓大鼠自主恢復(fù)。術(shù)后3 d每日1次腹腔注射青霉素16萬(wàn)U，預(yù)防感染。

1.3 在體血管收縮性評(píng)價(jià)

包管術(shù)后 3 d（n=6）、1 周（n=6）、2周（n=6），用以上方法麻醉大鼠，暴露雙側(cè)頸動(dòng)脈，去除右頸動(dòng)脈包裹的硅膠管。將頸動(dòng)脈置于已預(yù)熱的超聲血流量探頭（2PSB，Transonic Systems Inc.，USA）內(nèi)，穩(wěn)定2 min后用超聲實(shí)時(shí)外周血管血流量?jī)x（TS420，Transonic system Inc.，USA）測(cè)定血流量（ml/min），同時(shí)用MP150多導(dǎo)生理記錄儀（Biopac Systems，USA）連續(xù)記錄頸動(dòng)脈血流波形圖。測(cè)完兩側(cè)基礎(chǔ)頸動(dòng)脈血流量后，用寬4 mm、4層厚紗布條圍繞頸動(dòng)脈中段。待血流量穩(wěn)定，往紗布條上滴注用生理鹽水配置的 5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT，美國(guó) Sigma公司）0.05 ml。局部5-HT用量依次遞增：10μg、50μg、100μg、500μg。每次局部應(yīng)用 5-HT 后持續(xù)觀察2 min，記錄頸動(dòng)脈血流量最大變化值，并連續(xù)記錄血流量變化波形圖。取出紗布條，室溫生理鹽水局部沖洗后更換新紗布條。穩(wěn)定5~10min后進(jìn)行下一濃度的5-HT誘發(fā)實(shí)驗(yàn)，直至結(jié)束。兩側(cè)頸動(dòng)脈依次進(jìn)行。為排除頸動(dòng)脈血流量的個(gè)體差異，血管對(duì)5-HT的反應(yīng)以與自身基礎(chǔ)血流量比變化的百分?jǐn)?shù)表示。

1.4 病理學(xué)檢查

分別于術(shù)后 3 d（n=4）、1 周（n=4）、2 周（n=4）按前述方法麻醉大鼠，暴露雙側(cè)頸動(dòng)脈，取目標(biāo)血管（包管部位頸動(dòng)脈及對(duì)側(cè)相同部位頸動(dòng)脈）約10 mm長(zhǎng)。冰鹽水沖洗后4%多聚甲醛固定，石蠟包埋標(biāo)本。石蠟標(biāo)本按3～4μm厚度連續(xù)切片，蘇木素-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下數(shù)碼照相輸入計(jì)算機(jī)。用Image Pluse圖像分析軟件進(jìn)行測(cè)量分析：測(cè)外彈力板圍繞面積（external elastielamina area，EELA）、內(nèi)彈力板內(nèi)面積（internal elastielamina area，IELA）、平均外彈力板內(nèi)管腔直徑及平均內(nèi)彈力板內(nèi)管腔直徑。計(jì)算中膜厚度（mediadiameter，MD）及中膜面積（mediaarea，MA）。MD=（平均外彈力板內(nèi)管腔直徑-平均內(nèi)彈力板內(nèi)管腔直徑）/2；MA=EELA-IELA。EELA代表血管總面積；對(duì)沒(méi)有內(nèi)膜增生的血管環(huán)，血管環(huán)管腔橫截面積（lumen area，LA）為IELA，對(duì)有新生內(nèi)膜形成的血管環(huán)測(cè)LA，計(jì)算內(nèi)膜增生面積（neointima area，NA）=IELA-LA。每個(gè)目標(biāo)血管取3張切片測(cè)量后取平均值作為該標(biāo)本的最終數(shù)值。硅膠管包裹導(dǎo)致血管形態(tài)學(xué)變化程度以與自身對(duì)照側(cè)頸動(dòng)脈比較變化的百分?jǐn)?shù)表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x±s表示，兩側(cè)頸動(dòng)脈血流量及形態(tài)學(xué)分析所測(cè)值比較用配對(duì)t檢驗(yàn)。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硅膠管包裹對(duì)大鼠頸動(dòng)脈血管形態(tài)學(xué)的影響

2.1.1 血管形態(tài)學(xué)改變：對(duì)照側(cè)頸動(dòng)脈手術(shù)后3 d、1周及2周血管形態(tài)無(wú)明顯改變。硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈損傷血管外膜后，包管側(cè)頸動(dòng)脈血管出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變。硅膠管包裹3 d，血管腔縮小、血管內(nèi)皮完整、內(nèi)彈力板輕度彎曲、血管壁增厚、血管外膜炎性細(xì)胞侵潤(rùn)。硅膠管包裹1周，血管腔明顯縮小、內(nèi)皮完整、內(nèi)彈力板極度彎曲、內(nèi)皮細(xì)胞變形并突向管腔、血管壁明顯增厚、血管外膜大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及滋養(yǎng)血管增生。硅膠管包裹2周，血管腔較包管1周時(shí)擴(kuò)大，出現(xiàn)彌漫性?xún)?nèi)膜增生，新生內(nèi)膜中主要是縱行排列的合成型的血管平滑肌細(xì)胞及單核炎性細(xì)胞；內(nèi)彈力板彎曲現(xiàn)象消失；血管中膜平滑肌細(xì)胞復(fù)制及單核炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管壁增厚；血管外膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較1周時(shí)減輕（圖1）。

2.1.2 形態(tài)學(xué)測(cè)量分析結(jié)果：形態(tài)學(xué)分析結(jié)果如表1所示。硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈3 d、1周及2周對(duì)照側(cè)頸動(dòng)脈的EELA、MA、MD及IELA均無(wú)明顯差異。與對(duì)照側(cè)比較：包管術(shù)后3 d包管側(cè)頸動(dòng)脈的EELA及MA無(wú)明顯變化、MD增加（23.04±5.96）%（P=0.009）、IELA 縮小（12.15±2.29）%（P=0.003）；包管術(shù)后1周包管側(cè)頸動(dòng)脈的EELA縮小（35.41±3.41）%（P<0.001）、MA無(wú)明顯變化、MD 增厚（61.65±10.32）%（P<0.001）、IELA 縮?。?5.17±3.84）%（P<0.001）；包管術(shù)后2周包管側(cè)頸動(dòng)脈的EELA、MA及IELA無(wú)明顯變化、MD增厚（31.52±4.56）%（P=0.012）、LA 縮小（37.17±4.57）%（P<0.001）、NA 平均（0.19±0.05）mm2。

表1 硅膠包裹后大鼠頸動(dòng)脈血管形態(tài)學(xué)變化分析（x±s）Tab.1 Effect of collar-induced adventitia injury on rat carotid morphometry（x ±s）

2.2 硅膠管包裹對(duì)大鼠頸動(dòng)脈血管收縮功能的影響

2.2.1 頸動(dòng)脈血流量的變化：硅膠管包裹術(shù)后3 d、1周、2周，包管側(cè)頸動(dòng)脈血流量均較對(duì)側(cè)明顯降低，包管 3 d時(shí)分別為（3.35±0.77）ml/min和（4.55±0.92）ml/min（P=0.028）；包管 1 周時(shí)分別為（2.79±0.71）ml/min 和（3.64±0.83）ml/min（P<0.001）；包管 2周時(shí)分別為 （2.92±0.35）ml/min 和（4.35±0.97）ml/min，（P=0.0091）。見(jiàn)圖 2。

表2 局部應(yīng)用5-HT大鼠兩側(cè)頸動(dòng)脈血流量變化率比較（x±s，%）Tab.2 Effects of collar-induced adventitia injury on vascular reactivity to serotonin（x±s，%）

2.2.2 頸動(dòng)脈血管對(duì)局部應(yīng)用5-HT的反應(yīng)：局部應(yīng)用遞增劑量（10~500μg）5-HT誘發(fā)血管痙攣（n=6）結(jié)果如表2所示。隨5-HT用量增加，兩側(cè)頸動(dòng)脈血流量均在基礎(chǔ)血流量的基礎(chǔ)上呈劑量依賴(lài)性降低。硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈3 d，在較低劑量5-HT（10~50μg）時(shí)，包管側(cè)頸動(dòng)脈血流量下降程度與對(duì)照側(cè)比較無(wú)明顯差異；在高劑量5-HT（100~500μg）時(shí)，包管側(cè)頸動(dòng)脈5-HT誘發(fā)的血流量降低程度明顯大于對(duì)照側(cè)。硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈1周，局部應(yīng)用遞增濃度的5-HT，包管側(cè)頸動(dòng)脈血流量下降程度明顯大于對(duì)照側(cè)，這種差異在較低濃度5-HT時(shí)更明顯，包管側(cè)頸動(dòng)脈5-HT誘發(fā)的最大血流量降低程度也明顯大于對(duì)照側(cè)。包管術(shù)后2周，包管側(cè)頸動(dòng)脈對(duì)局部應(yīng)用5-HT的反應(yīng)與對(duì)照側(cè)比較無(wú)明顯差異。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，用硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈造成血管外膜慢性損傷后，早期出現(xiàn)血管收縮功能的改變，表現(xiàn)為血管中膜平滑肌慢性收縮、血流量降低及血管對(duì)5-HT的收縮反應(yīng)增強(qiáng)；包管2周血管壁出現(xiàn)具有動(dòng)脈粥樣硬化早期特征的新生內(nèi)膜病損。

3.1 硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生

目前認(rèn)為血管外膜是血管壁主要的“損傷-感應(yīng)組織”。能“由外向內(nèi)”影響血管功能及結(jié)構(gòu)。眾多研究證實(shí)血管外膜損傷能在短期內(nèi)出現(xiàn)具有動(dòng)脈粥樣硬化早期特征的新生內(nèi)膜。多種損傷血管外膜的方法被用來(lái)制造動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型，包括外膜電刺激、血管外壓迫、外膜剝離及血管外膜包管等。硅膠管生物相容性好、柔軟、有彈性。Booth等［2］首先應(yīng)用其包裹兔頸動(dòng)脈制作動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型：將一非閉合的硅膠管包繞于兔頸動(dòng)脈外膜，在正常飲食的情況下，1周內(nèi)包管處出現(xiàn)具有動(dòng)脈粥樣硬化早期特征的新生內(nèi)膜病損。此后眾多研究均證實(shí)用硅膠包裹血管的動(dòng)物模型是研究動(dòng)脈粥樣硬化形成可靠、快速的方法。該動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)是：血管外包管不直接損傷血管中膜及內(nèi)膜；而且在同一動(dòng)物能同時(shí)得到正常及外膜受損的血管，因此可以利用兩側(cè)血管進(jìn)行自身對(duì)照研究。目前該動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用于研究動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制及藥物療效。以往多數(shù)該方面的研究主要是以兔頸動(dòng)脈作為目標(biāo)血管。但由于抗兔抗體較少，限制了該動(dòng)物模型的更廣泛應(yīng)用。大鼠具有飼養(yǎng)方便、抵抗力強(qiáng)、相關(guān)抗體多等優(yōu)勢(shì)。既往報(bào)道應(yīng)用球囊損傷大鼠血管內(nèi)膜能誘發(fā)與人類(lèi)動(dòng)脈粥樣硬化早期改變相似的病變［3］。本實(shí)驗(yàn)用大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈造成血管外膜慢性損傷，光鏡下觀察硅膠管包裹后3 d、1周及2周大鼠頸動(dòng)脈血管壁形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示硅膠管包裹損傷血管外膜后，大鼠頸動(dòng)脈血管壁出現(xiàn)與硅膠管包裹兔頸動(dòng)脈后相似的形態(tài)學(xué)變化。與以往報(bào)道的硅膠管包裹兔頸動(dòng)脈1周出現(xiàn)彌漫性?xún)?nèi)膜增生不同的是，本實(shí)驗(yàn)硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈后1周無(wú)明顯內(nèi)膜增生，包管2周才出現(xiàn)明顯的內(nèi)膜增生。被廣泛用于研究腦出血致血管痙攣的大鼠股動(dòng)脈模型也證實(shí)經(jīng)外膜刺激大鼠股動(dòng)脈7~12 d血管主要表現(xiàn)為慢性痙攣，未見(jiàn)內(nèi)膜增生性改變［4，5］。大鼠頸動(dòng)脈對(duì)包裹硅膠管的反應(yīng)與兔不完全相同，機(jī)理還不清楚，可能與動(dòng)物的種屬有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以以大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用硅膠管包裹頸動(dòng)脈的方法制作外膜損傷致動(dòng)脈粥樣硬化模型用于探討血管外膜在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用及治療方法。

3.2 硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈導(dǎo)致血管對(duì)5-HT反應(yīng)敏感性增加

冠脈痙攣是眾多缺血性心臟病包括變異型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死及猝死的基本發(fā)病機(jī)制。動(dòng)脈粥樣硬化在血管痙攣發(fā)病中具有重要的作用。目前認(rèn)為血管平滑肌細(xì)胞收縮性增強(qiáng)是動(dòng)脈粥樣硬化引起血管痙攣的主要發(fā)病機(jī)理。從聚集的血小板中局部釋放的5-HT是血管收縮的內(nèi)源性刺激。在多種動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型中觀察到血管選擇性的對(duì)5-HT的收縮血管反應(yīng)敏感性增加，如高膽固醇喂養(yǎng)的兔動(dòng)脈粥樣硬化模型［6］、高膽固醇喂養(yǎng)+球囊損傷豬冠脈血管內(nèi)膜［7］等。人體動(dòng)脈的離體研究顯示粥樣硬化血管對(duì)5-HT的收縮反應(yīng)性增加［8］。臨床研究顯示動(dòng)脈粥樣硬化的患者對(duì)5-HT收縮血管反應(yīng)的敏感性增高易誘發(fā)血管痙攣［9］。關(guān)啟剛等［10］用白介素1包裹豬冠狀動(dòng)脈外膜介導(dǎo)冠脈病變的動(dòng)物模型，證明在體情況下血管外膜慢性炎癥刺激能導(dǎo)致血管對(duì)5-HT的收縮反應(yīng)敏感性增加。硅膠管包裹兔頸動(dòng)脈動(dòng)物模型的早期研究證實(shí)，除了內(nèi)膜增厚，包管部位的血管對(duì)5-HT的反應(yīng)敏感性增加，且動(dòng)脈對(duì)5-HT的超敏先于內(nèi)膜增厚及其他與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的肉眼形態(tài)學(xué)變化［11］。以上研究為本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的構(gòu)建提供了充分的依據(jù)。本研究結(jié)果顯示硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈3 d，血管對(duì)5-HT的收縮反應(yīng)增加；包管1周，血管對(duì)5-HT的反應(yīng)敏感性及收縮反應(yīng)強(qiáng)度均明顯增加，與以上研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)外膜慢性損傷的早期階段血管中膜平滑肌細(xì)胞收縮性增強(qiáng)。硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈2周，隨著彌漫性新生內(nèi)膜形成，血管對(duì)5-HT的反應(yīng)敏感性及收縮反應(yīng)強(qiáng)度均恢復(fù)至對(duì)照側(cè)水平。

3.3 硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈導(dǎo)致血管中膜平滑肌細(xì)胞慢性持續(xù)性收縮

本實(shí)驗(yàn)利用硅膠管對(duì)血管外膜慢性刺激，構(gòu)建血管收縮性增強(qiáng)的動(dòng)物模型的另一依據(jù)來(lái)源于目前已廣泛應(yīng)用于研究蛛網(wǎng)膜下腔出血致腦血管痙攣機(jī)制的大鼠股動(dòng)脈模型，該動(dòng)物模型將自體血放置于大鼠股動(dòng)脈外證實(shí)血管外膜刺激能導(dǎo)致血管慢性痙攣，表現(xiàn)為血管中膜增厚，血管腔橫截面積縮?。?，5］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈損傷血管外膜后，包管部位血管腔橫截面積明顯縮小，同時(shí)伴損傷側(cè)頸動(dòng)脈血流量明顯降低。進(jìn)一步測(cè)量分析發(fā)現(xiàn)硅膠管包裹早期尤其是在包管后1周時(shí)血管外彈力板內(nèi)面積及內(nèi)彈力板內(nèi)面積均明顯縮小，中膜面積無(wú)變化、而中膜厚度明顯增加，同時(shí)伴有內(nèi)彈力板彎曲，說(shuō)明此階段血管腔縮小主要源于中膜平滑肌的慢性收縮，與早期Iplikcioglu等［12］在大鼠股動(dòng)脈觀察的結(jié)果一致。包管后2周同樣表現(xiàn)為血管腔橫截面積縮?。徊煌氖莾?nèi)彈力板彎曲現(xiàn)象消失，內(nèi)彈力板內(nèi)面積無(wú)明顯變化，出現(xiàn)彌漫性?xún)?nèi)膜增生，說(shuō)明此階段血管腔縮小主要源于血管壁結(jié)構(gòu)性重構(gòu)，表現(xiàn)為血管中膜增厚及新生內(nèi)膜形成。以上結(jié)果證實(shí)硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈刺激血管外膜的的早期階段血管中膜平滑肌細(xì)胞慢性持續(xù)性收縮，導(dǎo)致血管慢性痙攣。

血管外膜慢性損傷能引起血管收縮功能的改變，表現(xiàn)為血管中膜平滑肌慢性收縮、血流量降低及對(duì)血管5-HT的收縮反應(yīng)敏感性增強(qiáng)。血管收縮功能的改變出現(xiàn)在內(nèi)膜增生性病變之前。該動(dòng)物模型可以被用來(lái)研究血管外膜慢性損傷致血管痙攣的機(jī)制及觀察抗痙攣藥物的療效。

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