徐玲，曲秀娟，劉云鵬，劉靜，張曄，侯科佐

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，沈陽 110001）

胃癌是世界范圍內(nèi)最常發(fā)生的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者在診斷時(shí)已經(jīng)是晚期，5年生存率只有10%～15%［1］。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）是腫瘤壞死因子家族的成員之一。在體外研究中，TRAIL誘導(dǎo)許多腫瘤細(xì)胞的凋亡，對(duì)正常細(xì)胞毒性很小。但胃癌細(xì)胞對(duì)TRAIL不敏感［2］。TRAIL 與死亡受體 4（DR4）和死亡受體 5（DR5）結(jié)合后使受體三聚化，接著募集其他效應(yīng)分子形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC），隨后caspase活化，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。奧沙利鉑作為第三代含鉑藥物，在胃癌治療中已經(jīng)取得一定療效［3］。為提高胃癌對(duì)TRAIL的敏感性，本研究將奧沙利鉑和TRAIL聯(lián)合作用胃癌BGC823細(xì)胞，探討聯(lián)合用藥的機(jī)制，以及對(duì)PI3K/Akt通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

重組人TRAIL購(gòu)于美國(guó)Cytolab/Peprotech Asia公司。奧沙利鉑購(gòu)自Sanofi-Aventis公司。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司。胎牛血清購(gòu)于天津血液病研究所。RNase A購(gòu)于AMRESCO公司。碘化丙啶（PI）、甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）和 LY294002購(gòu)于Sigma-Aldrich公司?？筽-Akt，Akt及actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：人胃癌細(xì)胞株BGC823常規(guī)傳代培養(yǎng)，生長(zhǎng)于含有10%滅活胎牛血清，青霉素（100 U/ml）和鏈霉素（100 mg/ml）的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于37°C 5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)12 h后分別加入既定濃度的處理因素。16 h后分別收集對(duì)照組及處理組細(xì)胞，70%乙醇固定 4 h 后，加入 10 μl的 PI（20 μg/ml），避光孵育15 min，用FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，WinMDI軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 Western blot檢測(cè)蛋白變化：收集細(xì)胞，冷PBS洗2次后加入1%Triton裂解液［1%Triton X-100，50 mmol/L Tris-Cl （pH 7.4），150 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaF，1 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF，2 μg/ml aprotinin］，冰上裂解 30 min，之后高速離心（15 000 r/m）30 min，取上清，Lowry法進(jìn)行蛋白定量。將樣品與3×樣品緩沖液混合后，煮沸5 min，于10%的SDS-聚丙烯凝膠中電泳，之后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗 p-Akt，Akt及 actin 4°C孵育過夜。TBST［10 mmol/L Tris（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，0.1%Tween 20］洗4次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育30 min，TBST洗后，ECL法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)成像并分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以±s表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組間差異采用t檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRAIL作用BGC823細(xì)胞，只引起輕度的細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀分析顯示，10，100，1000 ng/ml的TRAIL作用BGC823細(xì)胞16 h，細(xì)胞凋亡率不超過12%（圖1）。結(jié)果表明，胃癌BGC823細(xì)胞對(duì)TRAIL耐藥。

2.2 TRAIL作用BGC823細(xì)胞后，使PI3K/Akt活化

Western blot結(jié)果顯示，100 ng/ml的TRAIL作用 BGC823 細(xì)胞 1 h，8 h，16 h，p-Akt的活化逐漸增強(qiáng)（圖 2A）。PI3K 抑制劑 LY294002（25 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞1 h后再予TRAIL作用16 h，p-Akt被抑制至基線水平（圖2B），同時(shí)細(xì)胞凋亡比率明顯升高［（12.7±3.1）% 和（3.5±1.1）%，P<0.05］（圖 2C）。結(jié)果提示，PI3K/Akt通路活化是胃癌BGC823細(xì)胞對(duì)TRAIL耐藥的原因之一。

2.3 奧沙利鉑增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的BGC823細(xì)胞凋亡

奧沙利鉑（38 μg/ml）作用 BGC823 細(xì)胞 16 h，明顯抑制了p-Akt的水平。奧沙利鉑（38 μg/ml）聯(lián)合TRAIL（100 ng/ml）作用 16 h，同樣抑制了 p-Akt的水平（圖 3A）。奧沙利鉑（38 μg/ml）作用 BGC823細(xì)胞16 h，細(xì)胞凋亡率為 15.8±3.2%。 奧沙利鉑（38 μg/ml）聯(lián)合 TRAIL（100 ng/ml）作用 16 h，凋亡比率提高到（35.5±4.5）%（圖3B）。聯(lián)合組和單藥組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05。結(jié)果表明，奧沙利鉑通過抑制Akt的活化提高胃癌BGC823細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。

3 討論

TRAIL作為能殺傷腫瘤的細(xì)胞因子，在腫瘤的治療中有很好的應(yīng)用前景，但胃癌細(xì)胞對(duì)TRAIL不敏感。有報(bào)告顯示，當(dāng)SGC7901細(xì)胞用300 ng/ml的TRAIL處理24 h只引起了11.8%的細(xì)胞凋亡［4］。在我們的研究中，當(dāng)BGC823細(xì)胞用1 000 ng/ml的TRAIL處理16 h，細(xì)胞凋亡不超過12%。我們的結(jié)果顯示，胃癌BGC823細(xì)胞對(duì)TRAIL耐藥。

PI3K/Akt的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞增殖和阻止細(xì)胞凋亡［5，6］。在許多腫瘤中，Akt信號(hào)通路存在活化，這也是克服腫瘤對(duì)藥物耐藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)［7］。有研究報(bào)告［8］，PI3K/Akt的高度活化是TRAIL耐藥的原因之一。Chen等［9］報(bào)告在肝癌細(xì)胞中，TRAIL可誘導(dǎo)Akt磷酸化，進(jìn)一步增加肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的耐藥性。在我們的研究中，TRAIL作用BGC823細(xì)胞后，誘導(dǎo)Akt的磷酸化。而LY294002，PI3K特異的抑制劑，能抑制Akt的活化，并提高胃癌對(duì)TRAIL的敏感性。提示Akt通路的活化可能是胃癌細(xì)胞對(duì)TRAIL耐藥的原因之一。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，順鉑，紫杉醇和表柔比星等藥物能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性［10～12］。有研究報(bào)告，奧沙利鉑能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞Akt的磷酸化［13，14］，提示Akt可能是奧沙利鉑的作用靶點(diǎn)之一。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中，奧沙利鉑可以有效阻斷TRAIL誘導(dǎo)的Akt磷酸化，并增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。提示奧沙利鉑逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的耐藥可能是通過抑制了TRAIL誘導(dǎo)的PI3K/Akt生存通路活化。

綜上所述，我們的研究證實(shí)了在胃癌細(xì)胞中，奧沙利鉑可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性，其增效作用可能是通過抑制了TRAIL引起的PI3K/Akt活化，從而抑制生存通路。我們的結(jié)果表明，化療藥與TRAIL的聯(lián)合很可能成為今后胃癌治療的策略。

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