王文生，馬洪亮，高洋

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院心臟外科，沈陽 110004）

心肌缺血再灌注損傷雖然是臨床實(shí)踐中常見的組織器官損傷，但其準(zhǔn)確機(jī)制仍不十分清楚。研究表明多種生長(zhǎng)因子對(duì)心臟有保護(hù)作用，使其免受局部缺血及其再灌注損傷帶來的損害。雖然這些心肌保護(hù)因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路很復(fù)雜，但在很多情況下，抗細(xì)胞凋亡是它們的一個(gè)共同特征［1］。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3-K）-蛋白激酶 B（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog，AKT）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞的凋亡、存活、增殖以及細(xì)胞骨架的變化等活動(dòng)中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，其中尤為重要的是它對(duì)細(xì)胞凋亡、存活的調(diào)節(jié)作用［2］。近年來，對(duì)缺血/再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷機(jī)制的研究日益深入，對(duì)未成熟心肌保護(hù)的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步加深，提出了一些新的保護(hù)策略。其中，促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）的心肌保護(hù)作用引起了人們的關(guān)注［3］。本研究在初步觀察EPO預(yù)處理可明顯減輕心肌缺血再灌注損傷、對(duì)未成熟心肌具有一定的心肌保護(hù)作用及用量以EPO 5 000 U/kg效果最顯著的基礎(chǔ)上［4］，采用免疫組化和TUNNEL等方法進(jìn)一步探討EPO對(duì)未成熟心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用與PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

出生14～21 d的日本長(zhǎng)耳大白兔30只（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物室提供），體質(zhì)量230～300 g，雌雄不拘。30只日本大耳白幼兔隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組與EPO預(yù)處理組，每組15只。在模型建立前24 h，EPO預(yù)處理組經(jīng)腹腔注射EPO（5 000 U/kg，沈陽三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），對(duì)照組經(jīng)腹腔注射同體積的生理鹽水。

1.2 動(dòng)物模型的建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射10%烏拉坦（10 ml/kg）麻醉，腹腔注射肝素鈉（500 U/kg）抗凝。迅速取出心臟，經(jīng)主動(dòng)脈插管后，連接于灌注裝置上，建立Langendorff幼兔離體心臟灌注模型。主動(dòng)脈根部灌注37℃、95%O2+5%CO2混合氣持續(xù)氧合的K-H緩沖液，壓力7.98 kPa。經(jīng)15 min的自然灌流平衡后，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組分別用4℃心臟停搏液進(jìn)行停搏。停搏30 min后，以37℃K-H液再灌注120 min。取再灌注120 min的左室心肌進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法和觀察指標(biāo)

1.3.1 免疫組化法觀察心肌組織PI3K、AKT及caspase 9表達(dá)情況：PI3K、AKT及caspase 9表達(dá)均為胞質(zhì)染色，陽性者染成黃色或者棕黃色，陰性者不被染色，表達(dá)越強(qiáng)染色越深。應(yīng)用Imagepro-Plus軟件進(jìn)行各個(gè)標(biāo)本的平均光密度檢測(cè)。

1.3.2 TUNNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：凋亡細(xì)胞的核呈棕色或棕褐色著染細(xì)胞核形態(tài)呈碎點(diǎn)狀，不規(guī)整，大小不一致，而正常非凋亡細(xì)胞核被蘇木素復(fù)染呈藍(lán)色，核相對(duì)較大，形態(tài)大小較為一致，在物鏡（40×）下計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，選擇細(xì)胞總數(shù)200以上的視野，每個(gè)標(biāo)本觀察4張切片，取平均值，以心肌凋亡陽性細(xì)胞數(shù)占總心肌細(xì)胞數(shù)的百分比作為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，兩兩比較用多重比較t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PI3K、AKT及caspase 9的心肌組織含量表達(dá)

心肌缺血再灌注120 min后，EPO組PI3K和AKT的心肌組織含量表達(dá)明顯高于對(duì)照組（圖1、圖2），EPO組caspase 9的心肌組織含量則明顯低于對(duì)照組（圖3）。各免疫組化結(jié)果的平均灰密度值，EPO組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

表1 兩組心肌缺血再灌注2 h后PI3K、AKT及caspase 9表達(dá)的比較（±s）Tab.1 Comparison of PI3K，AKT and caspase9 expression in ischemia-reperfusion myocardiac cells at 2 h after reperfusion（±s）

表1 兩組心肌缺血再灌注2 h后PI3K、AKT及caspase 9表達(dá)的比較（±s）Tab.1 Comparison of PI3K，AKT and caspase9 expression in ischemia-reperfusion myocardiac cells at 2 h after reperfusion（±s）

1）P<0.01 vs control group.

Group n PI3K AKT Caspase-9 Control group 15 0.2687±0.0117 0.2384±0.0053 0.4334±0.0064 EPO-treated group 15 0.4138±0.00941） 0.4021±0.01361） 0.2449±0.01101）

2.2 心肌組織凋亡細(xì)胞的表達(dá)

心肌缺血再灌注120 min后，EPO組心肌組織凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯低于對(duì)照組（圖4）。心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) EPO 組（9.9±2.1）與對(duì)照組（15.9±1.5）比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。

3 討論

研究結(jié)果［5］表明很多心肌缺血再灌注損傷保護(hù)方式都是通過激活了PI3K-Akt信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管形成等作用而產(chǎn)生的。在PI3K家族中，IA型PI3K和其下游分子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt（或PKB）所組成的信號(hào)通路因其調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、存活和遷移等作用及與心肌保護(hù)發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，近年來備受矚目。Kennedy等［6］發(fā)現(xiàn)，在血清撤離后，即使活化的 Ras、Raf和Src也不能完全傳遞存活信號(hào)，相反，PI3K活性的抑制能促進(jìn)凋亡，而活化的AKT則能阻斷凋亡。很多研究者在離體心臟模型試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)［7，8］，在再灌注初期加入PI3K的抑制劑wortmannin可以抵消缺血后處理的心肌保護(hù)作用。活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白 Bad、caspase 9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27 Kip1等，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。Akt的激活不僅降低在體缺血再灌注模型中心肌細(xì)胞的死亡率，而且能真正地改善心肌局部和整體的功能。對(duì)細(xì)胞收縮和鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)量說明心肌細(xì)胞Akt的激活在體外能保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的功能障礙。Caspase是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)者和效應(yīng)器，AKT能夠磷酸化caspase 9使之失去其蛋白水解酶的活性，并進(jìn)一步抑制 caspase 9 下游分子包括 caspase 2，3，6，8，10引起的一系列的串聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而抗細(xì)胞凋亡［9］。

EPO是一種刺激骨髓造血的糖蛋白類激素，主要是由腎皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處的球旁細(xì)胞合成，分子量為30.4 kDa，其主要作用為促紅系祖細(xì)胞分化及分裂為成熟紅細(xì)胞，已廣泛用于治療腎衰竭，化療及外科手術(shù)等多種原因所造成的貧血。研究證實(shí)EPO受體（erythropoietin receptor，EPOR）廣泛分布于心血管系統(tǒng)，因此EPO在心血管系統(tǒng)中有著造血以外的多種生物作用［10］，近年來隨著研究的深入，其心肌保護(hù)作用逐漸受到關(guān)注。研究表明［10］EPO預(yù)處理在心肌缺血再灌注損傷中具有顯著的抗凋亡效應(yīng)；這一效應(yīng)與其上調(diào)抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)有關(guān)，而bcl-2是第一個(gè)被直接證實(shí)的PI3-K-Akt/PKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及存活的靶基因，故EPO預(yù)處理在心肌缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用可能與PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抗凋亡作用有關(guān)。

本次研究再次選用幼兔離體心臟缺血再灌注模型，排除了在體心臟受神經(jīng)、體液等多種因素的影響，從而觀察藥物對(duì)心臟的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：給予EPO預(yù)處理，可顯著提高缺血再灌注120 min后的心肌組織PI3K及AKT表達(dá)，并顯著降低缺血再灌注120 min后心肌組織caspase 9的表達(dá)。表明EPO預(yù)處理可能通過激活PI3K/AKT通路，激活PI3K，活化AKT的表達(dá)，進(jìn)而抑制凋亡相關(guān)基因caspase 9的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，從而對(duì)心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。另外，本實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組相比，EPO預(yù)處理組缺血再灌注120 min后的心肌凋亡細(xì)胞明顯較少，進(jìn)一步證實(shí)了EPO預(yù)處理可能是通過抗細(xì)胞凋亡來起到對(duì)缺血再灌注心肌的保護(hù)作用的。

［1］Abe J，Baines CP，Berk BC.Role of mitogen-activated protein kinases inischemiaandreperfusioninjury：thegoodandthebad［J］.CircRes，2000，86（6）：692-699.

［2］孫曉杰，黃常志.PI3K-Akt信號(hào)通路與腫瘤［J］.世界華人消化雜志，2006，14（3）：306-311.

［3］Hirata A，Minanino T，Asanuma H，et al.Erythropoietin enhances neovascularization of ischemic myocardium and improves left ventricular dysfunction after myocardial infarction in dogs［J］.J Am Coll Cardiol，2006，4：176-184.

［4］王文生，高洋，馬洪亮.促紅細(xì)胞生成素對(duì)幼兔心肌缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，38（6）：431-433.

［5］Matsui T，Nagoshi T，Rosenzweig A.Akt and PI3 kinase signaling in cardiachypertrophyandsurvival［J］.CellCycle，2003，2（3）：220-223.

［6］Kennedy SG，Wagner AJ，Conzen SD，et a1.The PI3-kinase／Akt sig－nalingpathwaydeliversananti-apoptoticsignal［J］.Genes Dev，1997，11（6）：701-713.

［7］Tsang A，Hauseuloy DJ，Moeanu MM，et al.Posteonditioning：a form of“modified reperfusion”protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol3-kinase-Aktpathway［J］.Circ Res，2004，95（3）：230-232.

［8］周春燕，陳玉培.PI3K／AKT信號(hào)通路在異丙酚減輕離體大鼠心臟缺血再灌注損傷中的作用［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2007，27（2）：151-155

［9］Zhou HL，Li XM，Meinkoth J，et al.Akt regulates cell survival and apoptosis at a postmitochondrial level［J］.J Cell Biol，2000，151（3）：483-494.

［10］Ruifrok WP，de Boer RA，Westenbrink BD，et al.Erythropoietin in cardiac disease：New features of an old drug［J］.Eur J Pharmacol，2008，585（2-3）：270-277.

［11］Mudalagiri NR，Mocanu MM，Di Salvo C，et al.Erythropoietin protects the human myocardium against hypoxia-deoxygenating injury via phosphatidylinositol-3 kinas and ERK1/2 activation ［J］.Br J Pharmacology，2008，153（1）：50-56.