曹東旭，遲晶

（1.武警遼寧總隊(duì)醫(yī)院 消化科，沈陽 110034；2.中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院消化科，沈陽 110001）

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率高、預(yù)后差，而胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致不良預(yù)后的重要因素。1994年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)宣布幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是人類胃癌的Ⅰ類致癌原，與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶 2（cyclooxygenase-2，COX-2）表達(dá)水平在大多數(shù)胃腸道腫瘤中明顯升高，從而促進(jìn)腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移；抑制COX-2的表達(dá)，可抑制胃腸道腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，但其機(jī)制不詳［1］。因此，本研究分析H.pylori感染的胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)檢測COX-2的表達(dá)情況，以探討COX-2表達(dá)對H.pylori感染的胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2005年9月至2007年9月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)的胃癌手術(shù)切除標(biāo)本60例，其中乳頭狀腺癌15例，管狀腺癌21例，低分化腺癌8例，黏液腺癌7例，未分化癌5例，印戒細(xì)胞癌3例，腺鱗癌1例；TNM分期：T1期26例，T2~T4期34例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例；高/中分化26例；低/未分化34例。所有患者術(shù)前均無非甾體抗炎藥物、糖皮質(zhì)激素類藥、根除H.pylori藥物治療史及放、化療等針對腫瘤的干預(yù)史。

1.2 方法

1.2.1 改良的Giemsa染色法判斷胃癌組織中H.pylori的感染情況：高倍鏡下以見到典型的螺旋形、S形或海鷗形，染成藍(lán)黑色的細(xì)菌確定為H.pylori感染陽性。

1.2.2 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化染色法（S-P法）檢測胃癌組織中COX-2的表達(dá)：兔抗人COX-2單克隆抗體（濃縮型）超敏S-P試劑盒、DAB底物顯色劑，均購自福建邁新公司。COX-2單克隆抗體工作濃度1∶200。染色具體步驟：石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度水化后，置3%的過氧化氫溶液中室溫下15 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，置10 mmol/L的檸檬酸緩沖液（pH6.0）中，用微波處理（100℃，5 min×3次），經(jīng)抗原修復(fù)，冷卻至室溫；滴加正常山羊血清，室溫下孵育15 min，以封閉正常非特異性抗原；傾去血清，滴加按工作濃度稀釋后的COX-2抗體，4℃放置過夜，PBS液浸洗3次，每次5 min。滴加生物素化二抗，37℃放置30 min，PBS液浸洗3次，每次5 min。滴加S-P復(fù)合物37℃30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、中性樹膠封片。每次染色均采用PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判定：高倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，求出陽性細(xì)胞的百分比，陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性，反之為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗(yàn)分析H.pylori感染與患者臨床病理特征及COX-2表達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H.pylori感染與胃癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性

60例胃癌標(biāo)本經(jīng)改良的Giemsa法染色，其中36例（60.0%）存在H.pylori感染。H.pylori感染與胃癌病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有相關(guān)性，而與患者年齡、性別及組織分化程度無相關(guān)性（表1）。

2.2 H.pylori感染與COX-2表達(dá)的相關(guān)性

免疫組化結(jié)果顯示，36例H.pylori感染的胃癌中，34例（94.4%）COX-2染色陽性，24例H.pylori感染陰性的胃癌中，僅9例（37.5%）COX-2染色陽性。H.pylori感染陽性和陰性的胃癌中COX-2的陽性表達(dá)率差異顯著（χ2=24.326，P＜ 0.01）。見圖1。

3 討論

自1983年H.pylori被發(fā)現(xiàn)以來，H.pylori感染已經(jīng)被認(rèn)為是胃癌發(fā)病的重要原因［2，3］。胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，其致死率在所有癌癥中高居第二位。其較高的致死率常與其較早發(fā)生局部侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。已有研究證實(shí)H.pylori能促進(jìn)胃癌上皮細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移［4］。本研究采用改良的Giemsa法染色顯示，H.pylori感染率為60.0%，本研究發(fā)現(xiàn)H.pylori感染與胃癌病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況相關(guān)，而與患者年齡、性別及組織分化程度無相關(guān)性。表明H.pylori陽性的胃癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移，與以往的研究結(jié)果一致［5］。說明H.pylori感染可能促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

表1 H.pylori感染與胃癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性Tab.1 The correlation between H.pylori infection and the clinicopathological features of gastric cancer

H.pylori感染促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制不清，可能與COX-2的高表達(dá)有關(guān)。以往Murata等［6］用Western blot檢查15例胃癌組織和癌旁鄰近組織中COX-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌患者中COX-2的過度表達(dá)與癌細(xì)胞累及淋巴管和轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)的程度密切相關(guān)，同時(shí)也和腫瘤的TNM臨床分期相關(guān)。COX-2的過度表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示患者的預(yù)后不佳。近年來Lee等［7］對109例胃癌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)COX-2蛋白有過度表達(dá)，其陽性率為64.2%。Xia等［8］對61例胃癌組織進(jìn)行研究亦發(fā)現(xiàn)H.pylori感染促進(jìn)胃癌組織COX-2的表達(dá)。本研究胃癌組織中COX-2的陽性率為71.7%（43/60），與文獻(xiàn)報(bào)道相近。本研究免疫組化染色結(jié)果顯示，H.pylori感染的胃癌組織中COX-2陽性表達(dá)率為94.4%（34/36），無H.pylori感染的胃癌組織中COX-2陽性率為 37.5%（9/24），差異顯著（P＜0.01）。提示H.pylori感染可能促使胃癌組織COX-2高表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移。H.pylori感染可誘導(dǎo)胃黏膜上皮COX-2表達(dá)，其機(jī)制如下：（1）H.pylori感染導(dǎo)致胃黏膜損傷，刺激COX-2表達(dá)：H.pylori黏附于胃黏膜上皮，釋放毒力因子，造成上皮細(xì)胞變性、壞死，炎細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致上皮損傷，已有研究證明，胃上皮損傷誘導(dǎo) COX-2 表達(dá)［9］；（2）H.pylori感染直接誘導(dǎo)COX-2表達(dá)：Kim等［10］應(yīng)用水溶性蛋白及活菌刺激人中性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)COX-2、前列腺素2均上調(diào)，分別加用特異性COX-2抑制劑NS-398、κB核因子（nuclear factor-kappa B，NF-κB）抑制劑、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶抑制劑后，COX-2、前列腺素2合成下降；（3）NF-κB 途徑：體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) NF-κB 能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞過度表達(dá)COX-2，有研究用H.pylori刺激人的胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)COX-2 mRNA和蛋白水平與NF-κB活性呈正相關(guān)，且能被 PDTA 所抑制［9］，據(jù)此推測，H.pylori感染可能通過激活NF-κB，進(jìn)而促進(jìn)COX-2的表達(dá)，與炎癥及新生物的發(fā)生有關(guān)；（4）H.pylori感染刺激生長因子和細(xì)胞因子釋放，繼發(fā)COX-2 表達(dá)：H.pylori感染可刺激 IL-8、TNF-α、iNOS等細(xì)胞因子的產(chǎn)生和表皮生長因子等生長因子的釋放［11］，而COX-2表達(dá)可被這些刺激因素誘導(dǎo)。總之，H.pylori感染誘導(dǎo)COX-2表達(dá)機(jī)制及其調(diào)解通路尚未十分明確，有待進(jìn)一步研究。

本研究證實(shí)了H.pylori感染可能增加胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力，其機(jī)制可能與COX-2的表達(dá)增加有關(guān)，為臨床應(yīng)用COX-2的特異性抑制劑來延緩或阻止胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移提供了理論基礎(chǔ)。

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