陳鐸，袁江偉，宋磊，魏翔泰，關(guān)俊宏，劉云會(huì)，宗志紅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽(yáng) 110004；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，沈陽(yáng) 110001）

最新的研究結(jié)果顯示，蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后72 h內(nèi)存在早期腦損傷（early brain injury，EBI），3～5 d 后發(fā)生腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS），上述二者是造成SAH患者死亡或重殘的最主要原因［1］。然而，EBI的確切分子病理機(jī)制尚不清楚，細(xì)胞凋亡機(jī)制可能參與了其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［2］。c-Jun 氨基端激酶（c-Jun N terminal kinase，JNK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了多種疾病的細(xì)胞凋亡過(guò)程［3］。腦損傷后發(fā)生的腦水腫病理改變與血腦屏障的開(kāi)放密切相關(guān)，Claudin-5和ZO-1是最重要的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白，它們的異常在血腦屏障開(kāi)放中起關(guān)鍵作用［4，5］。本研究擬通過(guò)檢測(cè)大鼠SAH后早期腦皮層微血管緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5和ZO-1的表達(dá)及JNK抑制劑對(duì)其表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討SAH后早期腦損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量300～350 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組（sham組）、蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）組、SAH+DMSO組、SAH+SP600125（10 mg/kg）組 和 SAH+SP600125（30 mg/kg）組，每組15只。SAH+二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、SAH+SP600125（10 mg/kg）和SAH+SP600125（30 mg/kg）組。在建立SAH模型基礎(chǔ)上分別于實(shí)驗(yàn)前1h和實(shí)驗(yàn)后6h向腹腔內(nèi)二次注入載體藥物DMSO（Calbiochem公司）或JNK抑制劑SP600125（Sigma公司），每組大鼠中5只用于電鏡形態(tài)學(xué)觀察，10只用于Western blot檢測(cè)Claudin-5、ZO-1的表達(dá)。

1.2 大鼠SAH模型的建立

采用血管內(nèi)穿刺法建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型［6］：用 10%水合氯醛（300 mg/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉后，氣管內(nèi)插管，固定頭部及四肢，做頸部正中3 cm切口，分離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，電凝切斷頸外動(dòng)脈近分叉處分支（包括枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈及咽升動(dòng)脈），分離結(jié)扎并切斷頸外動(dòng)脈，使頸外動(dòng)脈近心端成一約5 mm長(zhǎng)的殘端，用2個(gè)無(wú)損傷動(dòng)脈夾分別夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈起始段約3～5 mm處用眼科剪剪一“V”型小切口，下拉頸外動(dòng)脈，與頸內(nèi)動(dòng)脈成一直線，再將1根長(zhǎng)約5 cm的3-0尼龍線從頸外動(dòng)脈上的“V”型小切口導(dǎo)入，經(jīng)頸總動(dòng)脈達(dá)頸內(nèi)動(dòng)脈，松開(kāi)頸內(nèi)動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾，順著頸內(nèi)動(dòng)脈向遠(yuǎn)端繼續(xù)插入尼龍線至頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)段，有小的阻力感后再插入約2～3 mm刺破頸內(nèi)動(dòng)脈分叉部，迅速抽出尼龍線，用動(dòng)脈夾夾住頸外動(dòng)脈殘端，松開(kāi)頸總動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾恢復(fù)血流，結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端，縫合頸部切口。術(shù)中股動(dòng)脈插管接多導(dǎo)生理儀監(jiān)測(cè)血壓，維持肛溫（37.5±0.5）℃，并定時(shí)測(cè)血?dú)夥治?。sham組除了不刺破血管壁外，其余操作均與SAH組一致。

1.3 透射電鏡觀察大鼠腦皮層微血管超微結(jié)構(gòu)

SAH模型建立24 h后處死大鼠，2%戊二醛溶液進(jìn)行全身灌流，在冰盤內(nèi)摘取大鼠腦皮質(zhì)組織，迅速切成1 cm×1 cm×1 cm的小塊，3%戊二醛溶液中預(yù)固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗，1%四氧化鋨固定，梯度乙醇脫水，定向包埋，定位后制成超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙染色后，于透射電鏡下觀察、鑒別皮層神經(jīng)元與皮層微血管組織，并照像。觀察腦皮層微血管超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4 Western blot檢測(cè)Claudin-5、ZO-1表達(dá)的變化

取各組大鼠新鮮大腦皮質(zhì)，常規(guī)提取蛋白，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，4℃轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，5%脫脂奶粉封閉；加入1∶500稀釋山羊抗鼠多克隆抗體（Santa公司），4℃孵育過(guò)夜；二抗室溫孵育2 h，DAB顯色，照像。以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照。膠片掃描后，用Scion Image for Windows軟件分析各條帶的平均灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用率表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)量資料用x±s表示，各組之間行ANOVA方差分析。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2．1 大鼠SAH后24 h神經(jīng)行為功能缺損評(píng)分

SAH后24 h對(duì)存活大鼠參照Bederson法［7］進(jìn)行神經(jīng)行為功能缺損評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表1。在SAH組和SAH+DMSO組中神經(jīng)行為功能缺損評(píng)分集中在3 分和 4 分；SAH+SP600125（10 mg/kg）組集中在 2分和3分，而SAH+SP600125（30 mg/kg）組集中在1分和2分，說(shuō)明JNK抑制劑SP600125可改善SAH存活大鼠神經(jīng)行為功能缺損，SP600125（30 mg/kg）組尤為明顯；sham組無(wú)死亡，SAH組、SAH+DMSO組、SAH+SP600125（10 mg/kg） 組、SAH+SP600125（30 mg/kg）組死亡率分別為30%、35%、25%、15%，各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 SAH后24 h大鼠神經(jīng)行為功能缺損評(píng)分及死亡率Tab.1 Neurological deficit scores and mortality after SAH

2.2 SAH大鼠腦皮層微血管組織形態(tài)學(xué)變化及SP600125抑制劑對(duì)其影響

透射電鏡的結(jié)果（圖1）顯示，sham組大鼠腦皮層微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形，胞膜連續(xù)完整，細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核膜尚完整，胞質(zhì)內(nèi)有較多核糖體、線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間可見(jiàn)緊密連接，血腦屏障未開(kāi)放；SAH組和SAH+DMSO組血管內(nèi)皮細(xì)胞多凸向管腔，細(xì)胞核形不規(guī)則，有切跡，核內(nèi)異染色質(zhì)明顯邊集，細(xì)胞基質(zhì)密度降低，線粒體等細(xì)胞器減少，相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接明顯松散，血腦屏障明顯開(kāi)放；SAH+SP600125（10 mg/kg）組細(xì)胞核形不規(guī)則，有切跡，核內(nèi)異染色質(zhì)明顯邊集，核膜部分模糊，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)囊泡增多，相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接近腔面有部分松散，血腦屏障呈部分開(kāi)放；SAH+SP600125（30 mg/kg）組細(xì)胞核形不規(guī)則，有切跡，細(xì)胞膜部分破壞，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)空泡，變性的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接呈部分松散狀態(tài)，血腦屏障呈部分開(kāi)放。

2.3 SAH大鼠腦皮層微血管緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5和ZO-1的表達(dá)及SP600125對(duì)其影響

Western blot結(jié)果（圖2）表明，SAH組和 SAH+DMSO組Claudin-5和ZO-1表達(dá)水平下調(diào)，較sham組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；SAH組和 SAH+DMSO組之間比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與SAH、SAH+DMSO 組比較，SAH+SP600125（10 mg/kg）組Claudin-5和ZO-1的表達(dá)下調(diào)未受到明顯抑制（P＞0.05）；SAH+SP600125（30 mg/kg）組 Claudin-5 和 ZO-1 的表達(dá)下調(diào)則受到明顯抑制，10 mg/kg與30mg/kg SP600125兩組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

3 討論

3．1 SAH后早期腦損傷

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷是指SAH后72 h內(nèi)發(fā)生的一系列腦組織損害［8］。長(zhǎng)期以來(lái)眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)多集中在SAH后3～5 d延遲發(fā)生的腦血管痙攣機(jī)制的研究，我們的前期研究結(jié)果也證實(shí)了遲發(fā)性腦血管痙攣是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素之一［9，10］。然而，最近的研究結(jié)果提示，EBI也是造成患者死亡或重殘的最主要原因之一［1］。然而，EBI發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制目前尚不清楚，研究結(jié)果提示，細(xì)胞凋亡機(jī)制可能參與EBI的復(fù)雜分子病理形成過(guò)程。本研究結(jié)果證實(shí)，蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦皮層血管內(nèi)皮發(fā)生明顯損傷改變，與細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)的JNK抑制劑SP600125可明顯減輕血腦屏障形態(tài)破壞程度，并抑制腦皮層微血管緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5和ZO-1表達(dá)水平的降低，提示細(xì)胞凋亡機(jī)制可能參與了EBI復(fù)雜分子病理形成過(guò)程。

3．2 SAH后早期血腦屏障改變

研究顯示，SAH后早期腦損傷病理生理表現(xiàn)為顱內(nèi)壓升高，腦灌注壓和腦血流量下降，并引起急性缺血性改變，最主要病理表現(xiàn)為血管源性腦水腫，其機(jī)制尚不清楚。腦損傷繼發(fā)血管源性腦水腫等改變的分子病理學(xué)基礎(chǔ)是血腦屏障的破壞，最關(guān)鍵的核心環(huán)節(jié)是緊密連接相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)、功能改變。Claudin-5、ZO-1是分布于腦微血管內(nèi)皮間最重要的緊密連接相關(guān)蛋白，它們的結(jié)構(gòu)、功能異常是血腦屏障破壞的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4，5］。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，在正常狀態(tài)下，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接緊密無(wú)開(kāi)放；蛛網(wǎng)膜下腔出血后，血腦屏障明顯開(kāi)放，Western blot結(jié)果顯示，與sham組相比，SAH大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h腦皮層緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5、ZO-1的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），血腦屏障受到破壞。JNK抑制劑SP600125可明顯改善腦皮層微血管及神經(jīng)元形態(tài)學(xué)損傷程度，并抑制Claudin-5、ZO-1的表達(dá)降低，即抑制血腦屏障開(kāi)放程度，與透射電鏡觀察到的超微結(jié)構(gòu)的變化相一致。提示大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期血腦屏障結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生破壞性改變是早期腦損傷關(guān)鍵性機(jī)制之一；SP600125可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡通路，保護(hù)血腦屏障，發(fā)揮SAH早期腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明SAH后早期存在以血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞為主要特征的腦損傷，細(xì)胞凋亡可能參與了SAH后早期腦損傷分子病理學(xué)形成過(guò)程。

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