薛孟華,高素君,田慧敏,吳 勇,劉 偉*

(吉林大學第一醫(yī)院1.胸外科;2.血液腫瘤科,吉林 長春130021)

我國肺癌發(fā)病率和死亡率連年攀升[1],特別是非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)已經成為嚴重威脅人民健康的惡性腫瘤。14-3-3蛋白作為一種在真核細胞中廣泛表達且高度保守的調節(jié)蛋白,通過與細胞內靶蛋白相互作用而參與細胞信號傳導、細胞周期調節(jié)、凋亡、應激反應以及惡性轉化等各種細胞過程[2];現已研究證實14-3-3蛋白與多種惡性腫瘤包括肺癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關系[3],但是14-3-3蛋白由于有多種亞型且不同亞型在NSCLC發(fā)生和發(fā)展中的作用至今未明確[4-6];14-3-3蛋白的β亞型(14-3-3β蛋白)作為14-3-3蛋白家族中的一種重要亞型在NSCLC中的表達及其臨床意義目前尚未見詳盡報道。本研究利用組織芯片技術和免疫組織化學的方法來評價14-3-3β蛋白在NSCLC中的表達情況及其與臨床病理因素及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本組85例NSCLC石蠟組織切片取自1998年1月-2003年12月在吉林大學第一醫(yī)院胸外科行手術治療且隨訪資料完整的患者,所有病例均經術后病理證實;其中男性63例,女性22例;年齡在35-77歲之間,中位年齡62歲;無吸煙史者29例,有吸煙史者56例;根據 1997年國際抗癌聯盟(UICC)NSCLC分期標準,Ⅰ期39例,Ⅱ期24例,Ⅲ期22例;病理類型中鱗癌51例,腺癌 34例;隨訪截止日期為2008年4月8日,平均隨訪時間48±6個月。

1.2 組織芯片制備

復檢85例NSCLC石蠟組織HE染色切片,標記供體蠟塊靶點;利用組織芯片制作儀(Beecher Instruments公司),從供體蠟塊上穿取直徑為1 mm組織芯3條,依次插入有135個點陣的受體蠟塊中;在52℃恒溫烤箱中制作組織芯片蠟塊;以5 μ m厚度連續(xù)切片,陣列切片置于60℃恒溫烤箱中烤片16個小時;組織芯片進行HE染色復檢合格后置于5℃冰箱內保存待用。

1.3 免疫組化染色

1.3.1 試劑及方法 一抗采用兔抗人多克隆14-3-3β抗體(Santa Cruz公司),二抗采用DAKO二步法抗兔免疫組化檢測試劑盒(EnVision+/HRP/Rb),DAKO抗體稀釋液及顯色劑二氨基聯苯胺均購自DAKO公司。

1.3.2 結果判定 14-3-3β蛋白陽性染色信號位于胞漿,胞漿染色或胞漿、胞膜同時染色的細胞為陽性細胞;胞漿染色強度分 0-3級,0:陰性,1:弱陽性,2:中陽性,3:強陽性。

1.3.3 免疫組化染色評價 高倍鏡下計算14-3-3β蛋白表達陽性細胞百分比及陽性染色強度,每百個腫瘤細胞中陽性細胞數與染色強度乘積作為免疫組化染色評分,分值≥200者為陽性表達,＜200者即為陰性表達。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用 χ2檢驗分析14-3-3β蛋白陽性表達率與患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤大小、淋巴結狀態(tài)、病理類型及腫瘤分期等臨床病理因素的關系,P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義;單因素生存分析采用Kaplan-Meier法、經Log-rank差異性檢驗并繪制生存曲線,統(tǒng)計軟件采用SPSS13.0。

2 結果

85例NSCLC患者中14-3-3β蛋白表達陽性者40例(47%),陰性者45例(53%),14-3-3β蛋白在不同年齡、性別、吸煙狀況、病理類型、腫瘤大小、淋巴結狀態(tài)及腫瘤分期以及不同病理類型(鱗癌和腺癌)中的表達情況如表1所示。統(tǒng)計表明14-3-3β蛋白在鱗癌中的表達顯著高于腺癌(57%vs 32%,P＜0.05,14-3-3β蛋白在NSCLC中鱗癌和腺癌的陽性表達與陰性表達如圖1所示)。14-3-3β蛋白的表達與年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤大小、淋巴結有無轉移和腫瘤TNM分期無關。預后生存分析顯示14-3-3β蛋白陽性表達組中位生存期56個月,陰性表達組中位生存期42個月,14-3-3β蛋白陽性表達患者預后優(yōu)于陰性表達者,兩組具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.05)(生存率曲線如圖2所示)。

表1 14-3-3β蛋白的表達與NSCLC不同臨床病理因素的關系

圖1 14-3-3β蛋白在NSCLC鱗癌與腺癌組織中的陽性表達和陰性表達。(A:14-3-3β蛋白在鱗癌中的陽性表達;B:14-3-3β蛋白在腺癌中的陽性表達;C:14-3-3β蛋白在鱗癌中的陰性表達;D:14-3-3β蛋白在腺癌中的陰性表達;左圖 ×40,右圖×400。)

圖2 14-3-3β蛋白陽性表達患者和陰性表達患者生存率曲線(P=0.024)

3 討論

現已發(fā)現 14-3-3 蛋白家族具有β 、γ、ε、η、σ、θ和ζ等七種不同亞型,各種亞型通過與細胞內上百種靶蛋白相互作用,參與細胞信號轉導、細胞周期、轉錄、凋亡、應激反應、細胞黏附運動、細胞惡性轉化等細胞進程;本研究結果證明14-3-3β蛋白在NSCLC中存在較高表達,總陽性表達率為47.1%。14-3-3蛋白家族各個亞型功能是通過調節(jié)靶蛋白來實現,而這些靶蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能起著腫瘤抑制基因或原癌基因等截然不同作用[7,8],所以這一蛋白家族不同亞型有不同的促進或抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展作用。14-3-3β蛋白在NSCLC中作用機制尚不清楚,現有研究表明可能的機制有:(一)MAPK(Mito-Activated Protein Kinase)信號傳導通路的激活需要14-3-3β蛋白參與,而且MAPK活性增強與14-3-3β蛋白過度表達呈正相關,14-3-3β蛋白還可以通過與Raf-1相互作用來進一步促進MAPK信號通路激活,所以14-3-3β蛋白可通過促進MAPK活性增強來促進細胞增殖和向惡性細胞轉化;(二)14-3-3β蛋白與細胞內靶蛋白如PKC(Protein Kinase C)、PI3K(Phosphatidyl-3-Kinase)、磷酸化 Bad以及CDC25(Cell Division Cyclin 25)交互作用,參與細胞增殖和細胞周期調控等過程[9]。由此可見,14-3-3β蛋白在肺癌發(fā)生中主要起著原癌基因作用。

14-3-3蛋白家族另一重要特點是不同亞型對不同組織有不同親和性。如Qi等人發(fā)現14-3-3蛋白家族中β、γ、σ和θ亞型在肺鱗癌和腺癌中存在高表達,而ε和ζ亞型僅在正常肺組織中存在表達[10];目前關于NSCLC中14-3-3β蛋白在鱗癌和腺癌中的表達是否存在差異尚未見有關報道,本研究結果表明14-3-3β蛋白在鱗癌中陽性表達率為56.9%,而在腺癌中為32.4%,二者具有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05),可見14-3-3β蛋白可能與鱗癌發(fā)生有更密切關系。盡管本研究并未發(fā)現14-3-3β蛋白的表達在吸煙患者中與非吸煙患者中有明顯差異,但是由于肺鱗癌與吸煙有密切關系,而且有研究報道煙草中尼古丁可以通過激活ERK1/2(Extracellular signal-Regulated Kinase)、AKT、PKA(Protein Kinase A)來誘導 Bad多個位點磷酸化導致Bad與線粒體分離而與14-3-3β蛋白結合來抑制細胞凋亡[11],這可能是肺鱗癌中14-3-3β蛋白高表達的機制之一。

本研究未發(fā)現 14-3-3β蛋白表達與NSCLC性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結狀況及腫瘤分期等因素有關,但是通過單因素生存分析發(fā)現14-3-3β蛋白陽性表達者預后要好于陰性表達者,二者具有顯著統(tǒng)計學意義。目前尚未見國內外文獻有關14-3-3β蛋白與肺癌預后有關,但是有研究證實14-3-3β蛋白可以與Wee1直接結合,延長Wee1的半衰期從而提高細胞內Wee1蛋白的表達水平,增強Wee1激酶活性導致細胞周期停滯在G2-M期,進而誘導細胞凋亡[12],這可能是14-3-3β蛋白陽性的NSCLC患者預后較好的原因之一。當然,NSCLC的預后是由多種因素共同作用的結果,不能通過14-3-3β蛋白這一單一機制解釋。

14-3-3β蛋白作為調節(jié)蛋白,通過與多個靶蛋白結合可以把細胞內單一的信號傳導變成眾多的網絡化信號傳導,而且在不同細胞信號傳導途徑之間、在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的不同階段可能會扮演不同角色。正如前所述,14-3-3β蛋白在非小細胞肺癌中可能存在著多種作用,如14-3-3β蛋白可能與某些靶蛋白(如MAPK、Bad)結合起到促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用,也可能在某些情況下與另外靶蛋白(如Wee1)結合,起到促進腫瘤細胞凋亡從而抑制腫瘤的作用。

綜上,本研究通過組織芯片技術和免疫組織化學方法進一步證實了14-3-3β蛋白在NSCLC中的表達,并證明14-3-3β蛋白在鱗癌中表達高于腺癌,且14-3-3β蛋白陽性表達者預后好于陰性表達者;隨著對14-3-3β蛋白研究的進一步深入,期待著將來14-3-3β蛋白可以作為NSCLC早期診斷、靶向治療、預判斷后、療效監(jiān)測等方面的重要生物標記物。

[1]Yang L,Parkin DM,Ferlay J,et al.Estimates of cancerincidence in China for 2000 and projections for 2005[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2005,14:243.

[2]van Hemert MJ,Steensma HY,van Heusden GP.14-3-3 proteins:key regulators of cell division,signaling and apoptosis[J].Bioessays,2001,23:936.

[3]Nakanishi K,Hashizume S,Kato M,et al.Elevated expression levels of the 14-3-3 family of proteins in lung cancer tissues[J].Hum Antibodies,1997,8:189.

[4]Li DJ,Deng G,Xiao ZQ,et al.Identificating 14-3-3 sigma as a lymph node metastasis-related protein in human lung squamous carcinoma[J].Cancer Lett,2009,279(1):65.

[5]Osada H,Tatematsu Y,Yatabe Y,et al.Frequent and histological typespecific inactivation of 14-3-3sigma in human lung cancers[J].Oncogene,2002,21(15):2418.

[6]Nakajima T,Shimooka H,Weixa P,et al.Immunohistochemical demonstration of 14-3-3 sigma protein in normal human tissues and lung cancers,and the preponderance of its strong expression in epithelial cells of squamous cell lineage[J].Pathol Int,2003,53(6):353.

[7]Yip-Schneider MT,Miao W,Lin A,et al.Regulation of the Raf-1 kinase domain by phosphorylation and 14-3-3 association[J].Biochem J,2000,351(Pt 1):151.

[8]Seimiya H,Sawada H,Muramatsu Y,et al.Involvement of 14-3-3 proteins in nuclear localization of telomerase[J].EMBO J,2000,19(11):2652.

[9]Takihara Y,Matsuda Y,Hara J.Role of the beta isoform of 14-3-3 proteins in cellular proliferation and oncogenic transformation[J].Carcinogenesis,2000,21(11):2073.

[10]Qi W,Liu X,Qiao D,et al Isofor m-specific expression of 14-3-3 proteins in human lung cancer tissues[J].Int J Cancer,2005,113(3):359.

[11]Jin Z,Gao F,Flagg T,et al.Nicotine induces multi-site phosphorylation of Bad in association with suppression of apoptosis[J].J Biol Chem,2004,279(22):23837.

[12]Wang Y,JacobsC,HookKE,et al.Binding of 14-3-3beta to the carboxyl terminus of Wee1 increases Wee1 stability,kinase activity,and G2-M cell population[J].Cell Growth Differ,2000,11(4):211.