駱耐香 陳森洲 徐雅娟

(桂林醫(yī)學(xué)院,廣西 桂林 541004)

大多數(shù)腫瘤相關(guān)抗原(TAA)是自身抗原,由于胸腺的選擇機(jī)制和耐受機(jī)制,機(jī)體針對(duì)這些抗原產(chǎn)生的 T淋巴細(xì)胞中大多數(shù)T細(xì)胞受體(TCR)的親和力都比較低,從而限制了其腫瘤識(shí)別及殺傷效果。將克隆的高親和力識(shí)別 TAA的T淋巴細(xì)胞受體也稱嵌合免疫受體(CIR)通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染給 T淋巴細(xì)胞,可以使重定向的原來無腫瘤識(shí)別能力的 T細(xì)胞在體外和體內(nèi)有效識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞〔1〕。近年來利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的 T淋巴細(xì)胞嵌合免疫受體,它包括識(shí)別TAA的單鏈抗體(scFv)和T淋巴細(xì)胞的活化基序,通過真核細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞,使 T淋巴細(xì)胞能識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞。我們將含人源化抗癌胚抗原(CEA)scFv的 4種 CIR,即 CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3,轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞后檢測(cè)其在人 T淋巴細(xì)胞的表達(dá),篩選出高表達(dá)的CIR,為進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ),同時(shí)為這一治療策略最終應(yīng)用于臨床提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和材料 電穿孔儀NucleofectorTM為Amaxa Biosystems公司產(chǎn)品,流式細(xì)胞儀 FACS Calibur為美國 BD Biosciences公司產(chǎn)品。培養(yǎng)基AIM-V購自Sigma公司。健康人外周血由福岡紅十字血液中心提供。CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3為本研究室制備,見圖 1。別藻蘭蛋白(APC)標(biāo)記試劑盒購自日本Dojindo分子技術(shù)有限公司,按說明將其標(biāo)記 CEA。

圖1 四種 CIR基因(CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3)簡圖

1.2 細(xì)胞分離與培養(yǎng) 按常規(guī)方法分離淋巴細(xì)胞。將分離的人 T淋巴細(xì)胞在含 10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的 AIM-V培養(yǎng)基中,37℃含 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每 2天換液 1次,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞備用。

1.3 基因轉(zhuǎn)染 將 4種CIR通過電穿孔的方式轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞。按照產(chǎn)品說明,用 100μl電穿孔液 Nucleofector·Solution重懸 T細(xì)胞 2×106后,加入 4μg CIR,使用程序 A-23進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染后即移入預(yù)先預(yù)熱的 AIM-V培養(yǎng)液中,置 37℃含 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù) 首先在轉(zhuǎn)染后 16 h收獲并調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106/ml于 Eppendorf管中 ,分別加入 400μg/L CEA-APC與 FACS-PBS混合液 200μl,混勻于冰上 1 h,每隔 15 min顛倒混勻,PBS洗 2次后,懸浮于 500μl FACS Flow溶液中,采用流式細(xì)胞儀 FACSCalibur檢測(cè)分析不同的 CIR在 T細(xì)胞表面與CEA定向結(jié)合情況。以不含基因的空載體經(jīng)電穿孔后作為陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

CIR1、CIR2、CIR3可有效表達(dá)在 T細(xì)胞表面,與 CEA-APC發(fā)生定向結(jié)合,曲線高出陰性對(duì)照并向右移,其中 CIR3效果更好,而 CIRZ未與 CEA-APC結(jié)合,見圖 2。

圖2 4種CIR在人T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析

3 討 論

腫瘤過繼免疫治療雖然成功地應(yīng)用于黑色素瘤和腎細(xì)胞癌的治療,但對(duì)結(jié)腸癌、乳腺癌等實(shí)體腫瘤的治療效果并不滿意,其主要原因可能是培養(yǎng)足夠的腫瘤特異性淋巴細(xì)胞非常困難。隨著分子生物學(xué)技術(shù)及基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展,構(gòu)建T淋巴細(xì)胞的 CIR成為可能,CIR包含識(shí)別 TAA的單鏈抗體和T淋巴細(xì)胞活化的協(xié)同刺激分子 CD28、CD3ζ鏈等,通過體外轉(zhuǎn)染到 T淋巴細(xì)胞的表面,以發(fā)揮抗腫瘤功能。

CEA是目前研究最廣而且最具有潛力的靶抗原之一。它是一類主要的TAA,為分子量為 180 000的糖蛋白,最先是在結(jié)腸癌提取物中發(fā)現(xiàn)的抗原。現(xiàn)已知 CEA不但廣泛存在于各種人類腫瘤細(xì)胞中,也存在于正常胃腸組織和胎兒小腸上皮細(xì)胞中,但正常組織中的CEA不直接分泌到血液和組織液中。因此,CEA可作為腫瘤免疫治療非常有用的一個(gè)靶分子〔2,3〕。機(jī)體有效抗腫瘤免疫需要免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別腫瘤抗原,并最終利用免疫效應(yīng)機(jī)制清除腫瘤細(xì)胞。大量的體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,用抗TAA的TCR重定向的T細(xì)胞具有特異性的腫瘤殺傷功能〔4,5〕。由于人源抗體比鼠源抗體在腫瘤的免疫治療和基因治療中有更大的潛力,我們構(gòu)建了 4種含人源抗CEA單鏈抗體的 CIR,分別為 CIRZ、CIR1、CIR2和 CIR3,而 CEA特異性CIR可以表達(dá)在 T淋巴細(xì)胞表面〔6〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有 3種 CIR(CIR1、CIR2、CIR3)可以在 T淋巴細(xì)胞表面表達(dá),其中 CIR3表達(dá)最好。與 CIRZ不同的是,3種可在T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)的CIR具有的共同之處是胞外段均有鉸鏈區(qū),推測(cè)這類CIR容易在細(xì)胞表面表達(dá),繼而可與 CEA發(fā)生結(jié)合。目前報(bào)道的所有臨床應(yīng)用的 CIR的信號(hào)傳導(dǎo)均使用 CD3ζ鏈,而近來的研究發(fā)現(xiàn),只用 CD3ζ鏈作為信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致活化的淋巴細(xì)胞凋亡,而在單鏈抗體與 CD3ζ之間加入共刺激分子(如 CD28)能有效地增強(qiáng)活化淋巴細(xì)胞的功能并防止細(xì)胞凋亡。我們利用人源化抗CEA的單鏈抗體的靶向性和CD3ζ胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)的共刺激信號(hào),構(gòu)建真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染 T細(xì)胞,旨在制備能活化的有CEA靶向性的外周血 T細(xì)胞來殺傷腫瘤細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)結(jié)合了殺傷性 T細(xì)胞的抗腫瘤作用與協(xié)同刺激分子兩大研究熱點(diǎn),使體液免疫與細(xì)胞免疫有機(jī)結(jié)合,利用了TCR/CD3ζ中抗原識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)的獨(dú)立性,將抗體分子的導(dǎo)向作用和T細(xì)胞活化所需的雙信號(hào)相結(jié)合,構(gòu)建scFv-CD3ζ腫瘤特異性T細(xì)胞能降低T細(xì)胞活化的閾值。而且構(gòu)建的腫瘤特異性 T細(xì)胞的殺傷功能由于不受 MHC限制有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值,可以提高抗腫瘤綜合免疫治療水平。

臨床研究表明,過繼性輸注腫瘤特異性 T淋巴細(xì)胞可通過抑制腫瘤細(xì)胞的生長而有效的治療腫瘤。臨床應(yīng)用的腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞可從腫瘤病人的外周血、淋巴結(jié)或者腫瘤組織中分離。美國國立癌癥研究所進(jìn)行的一期臨床試驗(yàn)中,對(duì) 17例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤病人用Mart1TCR基因修飾的自體外周血T淋巴細(xì)胞進(jìn)行治療,兩例病人出現(xiàn)客觀療效,這是首次基因治療有效用于腫瘤免疫治療的報(bào)道。在該兩例病人中持續(xù)檢測(cè)到高達(dá) 40%～70%的外周血細(xì)胞中含有基因標(biāo)記,并且長達(dá)一年之久〔7〕。隨著更多更好的 CIR的構(gòu)建及治療方案的改善,有望在用基因修飾的 T淋巴細(xì)胞治療腫瘤方面取得突破進(jìn)展。

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5 Rosenberg SA,Dudley ME.Adoptive cell therapy for the treatment of patients with metastatic melanoma〔J〕.Curr Op in Immunol,2009;21(2):233-40.

6 Shibaguchi H,Luo NX,Kuroki M,et al.A fully human chimeric immune receptor for retargeting T-cell to CEA-expressing tumor cells〔J〕.Anticancer Research,2006;26(6):4067-72.

7 Morgan RA,Dudley ME,Wunderlich JR,et al.Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes〔J〕.Science,2006;314(5796):126-9.