鄭智 李冬云 陳菊 劉朝陽(yáng) 陳信義

多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是白血病化療治療的最大難點(diǎn)，如何逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥也是國(guó)內(nèi)外研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。我們的臨床研究表明，分別由浙貝母、漢防己、川芎三味中藥組成的復(fù)方浙貝顆粒飲片(compound zhe bei granule，CZBG)與化療藥物伍用能夠提高難治耐藥性急性白血病患者骨髓緩解率，表明該方可能具有逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥效應(yīng)[1-4]；體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)也證明，該方中單味藥提取的活性成分能夠增加白血病細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物濃度，下調(diào)多藥耐藥相關(guān)蛋白基因(Pgp)高表達(dá)[5-7]?；谝陨媳尘百Y料，擬通過(guò)移植瘤實(shí)驗(yàn)，考察CZBG聯(lián)合阿霉素逆轉(zhuǎn)多藥耐藥白血病細(xì)胞K562/A02效果。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及動(dòng)物 K562/A02細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供；清潔級(jí)BALB/c-nu裸小鼠60只，8～10周齡，雌雄各半，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2005－0013，SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑 CO2培養(yǎng)箱，Heraeus；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清，Hyclone產(chǎn)品；復(fù)方浙貝顆粒(CZBG，浙貝母、漢防己、川芎)由北京康仁堂藥業(yè)有限公司制備并提供；注射用鹽酸多柔比星(doxorubicin，阿霉素)，深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H44024359。

1.3 方法

1.3.1 建立動(dòng)物模型 K562/A02細(xì)胞用含ADR1μg/mL的10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3d換液一次；收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，1000rpm，離心5min，無(wú)血清RPMI－1640培養(yǎng)基稀釋?zhuān)瞥杉?xì)胞懸液，細(xì)胞懸液密度4×107/mL，于裸鼠右前腋?jìng)?cè)皮下注射0.2mL，注射后2～7d可見(jiàn)到瘤塊開(kāi)始生長(zhǎng)增大，未見(jiàn)到瘤塊消退。

1.3.2 分組與給藥 K562/A02細(xì)胞接種后60只荷瘤鼠全部成瘤，測(cè)量腫瘤最大徑(a)和最小徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V):V=ab2/2，將腫瘤體積過(guò)大及過(guò)小者排除，共有50只荷瘤鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，分別為生理鹽水對(duì)照組，阿霉素對(duì)照組，CZBG高劑量組，CZBG中劑量組和CZBG低劑量組，每組各10只荷瘤鼠。細(xì)胞接種后第8天開(kāi)始給藥，其中，生理鹽水對(duì)照組以生理鹽水0.2mL/10g，灌胃，每日1次。阿霉素對(duì)照組以阿霉素1mg/kg(按成人40mg/(m2·d)換算)，腹腔注射，隔日1次。CZBG高劑量組(8g/kg，臨床用藥劑量的14倍)，灌胃給藥，每日1次；阿霉素1mg/kg腹腔注射，隔日1次。CZBG中劑量組(4g/kg，臨床用藥劑量的7倍)灌胃給藥，每日1次；阿霉素1mg/kg腹腔注射，隔日1次。CZBG低劑量組(2g/kg，臨床用藥劑量的3.5倍)灌胃給藥，每日1次；阿霉素1mg/kg腹腔注射，隔日1次。共14d。

1.3.3 瘤塊體積與抑瘤率計(jì)算 給藥后每4天用游標(biāo)卡尺測(cè)1次腫瘤體積，直至給藥結(jié)束前1天，取各組平均值，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束，完整剝離腫瘤，稱(chēng)瘤塊重量，并按照公式(抑瘤率(IR)=[1－(試驗(yàn)組瘤塊重量/對(duì)照組瘤塊重量)]×100%)計(jì)算抑瘤率。

圖1 各組移植瘤體積生長(zhǎng)曲線(xiàn)

表1 實(shí)驗(yàn)各組瘤重和抑瘤率

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法 各分組所得計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用SPSS10.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀(guān)察 各組動(dòng)物至實(shí)驗(yàn)結(jié)束無(wú)一只死亡，均全部進(jìn)入指標(biāo)檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組動(dòng)物能正常進(jìn)食，活動(dòng)自如，無(wú)明顯消瘦。

2.2 腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)比較 接種后第12天(給藥后第4天)，各組腫瘤生長(zhǎng)平緩，各組腫瘤體積比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；用藥后16d，CZBG各組生長(zhǎng)曲線(xiàn)較平緩，但未停滯，而對(duì)照組和阿霉素組生長(zhǎng)較快，曲線(xiàn)陡直；用藥后20d，CZBG各組與化療組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，CZBG高劑量組生長(zhǎng)最緩。各組腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

2.3 瘤重和抑瘤率比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，剝離腫瘤稱(chēng)重，并依據(jù)實(shí)驗(yàn)各組瘤重計(jì)算腫瘤抑制率，各組瘤重與抑瘤率見(jiàn)表1。從表1可以看出，CZBG中、高劑量伍用阿霉素能夠明顯提高抑瘤率，與阿霉素組比較，分別提高了68.9%(中劑量組)與145.5%(高劑量組)，表明CZBG中、高劑量能夠明顯增加阿霉素對(duì)耐藥性白血病細(xì)胞(K562/A02)殺傷的敏感性。

3 討論

研究表明，以多藥耐藥人白血病耐阿霉素的K562/A02細(xì)胞系建立的裸鼠耐藥移植瘤模型，仍保持近似體外的耐藥活性和基因表型，故該模型是一種良好的研究白血病多藥耐藥發(fā)生機(jī)制和逆轉(zhuǎn)耐藥的體內(nèi)動(dòng)物模型[8]。我們?cè)诶迷摷?xì)胞系開(kāi)展單味中藥提取的活性體外抗多藥耐藥機(jī)制研究基礎(chǔ)上，結(jié)合耐藥白血病的中醫(yī)臨床特點(diǎn)，在中醫(yī)辨證施治理論指導(dǎo)下擬定的復(fù)方浙貝顆粒(浙貝母、川芎、漢防己)，并通過(guò)(顆粒飲片)隨機(jī)雙盲、安慰劑對(duì)照、多中心臨床研究證實(shí)，該組中藥(復(fù)方)伍用化療藥物能夠明顯提高難治耐藥性急性白血病的骨髓緩解率，并具有較為明顯的抗化療不良反應(yīng)效果，說(shuō)明該組中藥具有化療增敏效應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中我們引用多藥耐藥人白血病耐阿霉素的K562/A02細(xì)胞移植瘤模型來(lái)研究復(fù)方浙貝顆粒增加阿霉素對(duì)耐藥移植瘤殺傷的敏感性，試圖通過(guò)該研究進(jìn)一步深入探討該方逆轉(zhuǎn)白血病耐藥機(jī)制。研究結(jié)果表明，復(fù)方浙貝顆粒不同給藥劑量均有不同程度的增加阿霉素對(duì)K562/A02移植瘤的殺傷效應(yīng)。其中，復(fù)方浙貝顆粒低劑量組伍用阿霉素與單用阿霉素的腫瘤抑制率相似；而復(fù)方浙貝顆粒高、中劑量組伍用阿霉素能夠明顯提高腫瘤抑制率，與單用阿霉素組比較，腫瘤抑制率分別提高了68.9%(中劑量組)與145.5%(高劑量組)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了復(fù)方浙貝顆粒伍用化療藥物能夠提高難治耐藥急性白血病骨髓完全緩解率的可靠性。對(duì)于復(fù)方浙貝顆粒增加阿霉素對(duì)K562/A02移植瘤的抑瘤機(jī)制，我們?cè)噲D通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織多藥耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡以及相關(guān)酶變化來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明。

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