高 穎,汪恩強(qiáng),馬玉忠,徐麗娜

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河北保定071001)

肝臟所含脂質(zhì)絕大部分為甘油三酯(triglyceride,TG),各種致病因素可導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi) TG異常堆積而導(dǎo)致脂肪肝(fatty liver,FL)的發(fā)生,同時(shí)伴隨肝臟功能紊亂[1]。脂肪肝的發(fā)病機(jī)制是極其復(fù)雜的,它的發(fā)生與肝臟TG輸出的相對(duì)不足和絕對(duì)不足而導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)大量堆積有關(guān)[2-3],至今尚不完全清楚。為更好的研究脂肪肝,首先要建立理想的研究模型。目前,對(duì)動(dòng)物脂肪肝的研究主要采用動(dòng)物體內(nèi)模型,存在個(gè)體差異較大,試驗(yàn)條件不易控制,整體影響因素眾多、周期較長(zhǎng)等缺點(diǎn),而細(xì)胞模型試驗(yàn)卻可以很好的克服上述缺點(diǎn),并且能針對(duì)性探究脂肪肝發(fā)病的細(xì)胞機(jī)理[4-5]。本文利用DL-乙硫氨酸誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞,對(duì)藥物導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性病理模型進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠,雄性,體重100～150g,清潔級(jí),由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

主要試劑和儀器:預(yù)灌流液、細(xì)胞洗液,參照參考文獻(xiàn)[6]配制;RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);膠原酶Ⅳ(Sigma公司);DL-乙硫氨酸(北京恒業(yè)中遠(yuǎn)公司);油紅O(分析純)(上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠);蘇木色精(北京化工廠);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司);超凈工作臺(tái)(德國(guó)Heraeus公司);倒置相差顯微鏡成像系統(tǒng)(OLYMPUS公司);光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)(JVC公司);6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NUNC公司);A-6型半自動(dòng)生化分析儀(北京松上技術(shù)有限公司)。

1.2 原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)[7-9]按二步灌流法獲取肝細(xì)胞后,用200目尼龍網(wǎng)布過(guò)濾,收集過(guò)濾液,以800 r/min離心3 min,去掉上清液,加入 RPMI-1640培養(yǎng)基使細(xì)胞重新懸浮,吹打幾次混勻,再離心,如此重復(fù)2次。計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞活力,稀釋細(xì)胞密度至1.5×105個(gè)/mL,鋪于6孔板中,每孔放置一塊滅菌的蓋玻片,置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h。

1.3 DL-乙硫氨酸處理大鼠肝細(xì)胞 待細(xì)胞貼壁,培養(yǎng)24 h后,用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。將貼壁生長(zhǎng)良好的肝細(xì)胞分為對(duì)照組,5.0 mmol/L DL-乙硫氨酸處理模型組,不換液培養(yǎng)48 h。

1.4 脂肪變性肝細(xì)胞染色和分析 培養(yǎng)48 h后,吸掉培養(yǎng)基,取出蓋玻片,同時(shí)用冷的 PBS(pH 7.2)沖洗蓋玻片3次,10%中性甲醛固定30 min,用油紅O染色,光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)觀察拍照。按Wada方法進(jìn)行脂質(zhì)染色半定量分析,每一塊玻片計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。所有數(shù)據(jù)均以表示,采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因子方差分析(One-Way ANOVA),0.01＜P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P＜0.01有極顯著性差異。

1.5 生化指標(biāo)測(cè)定 利用生化分析儀分別測(cè)定對(duì)照組和模型組48h細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的ALT,AST活性以及細(xì)胞裂解液中的TG含量,方法參照各試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。所有數(shù)據(jù)均以±S表示,采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因子方差分析。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞分離與培養(yǎng) 倒置顯微鏡下,新分離的肝細(xì)胞呈圓形或橢圓形,胞漿透亮,多成單個(gè)分散狀態(tài),少量成團(tuán)。用0.4%臺(tái)盼藍(lán)拒染計(jì)數(shù)顯示,95%細(xì)胞排斥染色。細(xì)胞接種數(shù)小時(shí)后,開(kāi)始貼壁,生長(zhǎng)良好,細(xì)胞為球形,邊界輪廓清晰(圖1,圖2)。

2.2 脂肪變性肝細(xì)胞染色與分析 光學(xué)顯微鏡下觀察,對(duì)照組細(xì)胞邊緣清晰、核大、細(xì)胞內(nèi)少見(jiàn)橘紅色脂滴,顏色淺(圖3);模型組細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)許多橘紅色的脂滴存在,且大部分細(xì)胞內(nèi)含多個(gè)脂滴,有的地方染色后模糊成片,顏色深,有的細(xì)胞膜邊緣已不完整,與對(duì)照組比較有顯著差異(圖4)。Wada方法進(jìn)行脂質(zhì)染色半定量分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表1),統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)代表細(xì)胞脂滴的面積等于或大于細(xì)胞核的面積的細(xì)胞,模型組與對(duì)照組比較有極顯著差異(P＜0.01)。

2.3 DL-乙硫氨酸作用48 h后ALT,AST活性與TG含量 用DL-乙硫氨酸處理貼壁培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞后,均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞損傷。肝細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示,作用48 h時(shí),

表1 DL-乙硫氨酸對(duì)培養(yǎng)的肝細(xì)胞作用48 h后Wada方法分析結(jié)果(±S,n=6)

表1 DL-乙硫氨酸對(duì)培養(yǎng)的肝細(xì)胞作用48 h后Wada方法分析結(jié)果(±S,n=6)

**:差異極顯著,P＜0.01

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模型組ALT,AST活性升高,與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.01,P＜0.05)。模型組細(xì)胞裂解液中TG含量升高,與對(duì)照組比較差異極顯著(P＜0.01)(表2)。

3 討論

脂肪肝模型建立是否成功,主要看其肝細(xì)胞的病理形態(tài)與TG含量的變化。在培養(yǎng)基中添加DL-乙硫氨酸培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞模型都有一個(gè)共同特征:細(xì)胞內(nèi)的TG含量增加了,油紅O染色在光學(xué)顯微鏡下顯示為橘紅色脂肪滴顆粒,符合脂肪化肝細(xì)胞特點(diǎn),表明DL-乙硫氨酸作用于肝細(xì)胞,能夠使肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂,從生化指標(biāo)數(shù)據(jù)看出,TG從0.179 mmol/L增加到1.361 mmol/L,說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)有大量TG聚集,造模成功。細(xì)胞膜完整性受到破壞,轉(zhuǎn)氨酶就會(huì)從受損的肝細(xì)胞內(nèi)釋放到培養(yǎng)基中。模型組培養(yǎng)基中ALT,AST的活性比對(duì)照組的活性明顯增高,說(shuō)明DL-乙硫氨酸破壞細(xì)胞膜完整性,這在細(xì)胞染片中也可反映出來(lái)。

生物膜是細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu),具有保護(hù)細(xì)胞的作用。在本細(xì)胞水平試驗(yàn)中,模型組培養(yǎng)基中ALT,AST的活性比正常組的活性明顯增高,說(shuō)明各濃度DL-乙硫氨酸對(duì)肝細(xì)胞有一定損傷,同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)TG積聚現(xiàn)象,與動(dòng)物水平的試驗(yàn)性脂肪肝基本一致,相對(duì)動(dòng)物試驗(yàn)而言,細(xì)胞試驗(yàn)的影響因素少,可行性高。故認(rèn)為,細(xì)胞水平的試驗(yàn)可以作為動(dòng)物水平試驗(yàn)的補(bǔ)充,二者的有機(jī)結(jié)合,將為進(jìn)一步研究脂肪肝的發(fā)病機(jī)制以及臨床治療藥物的篩選提供有效的途徑。

總之,DL-乙硫氨酸可誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性,引起細(xì)胞漿中脂肪滴含量增加,從而建立大鼠脂肪肝藥物損傷的體外模型,為在細(xì)胞水平篩選治療脂肪肝藥物提供參考模型。

表2 DL-乙硫氨酸對(duì)培養(yǎng)的肝細(xì)胞作用48 h后ALT、AST和TG的影響(±S,n=6)

表2 DL-乙硫氨酸對(duì)培養(yǎng)的肝細(xì)胞作用48 h后ALT、AST和TG的影響(±S,n=6)

*:差異顯著,0.01＜P＜0.05;**:差異極顯著,P＜0.01

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