馬 君,王 棟,于康震,汪 明

(1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院農業(yè)部人畜共患病重點開放實驗室,北京海淀100193;2.北京海淀中海動物保健科技公司,北京海淀100081;3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京海淀100081)

本課題組自2004年開始動物狂犬病滅活疫苗(FLury LEP株)的研制,在對疫苗進行評價的過程中,對一份來自廣西的狂犬病病犬腦組織進行了鑒定,旨在為疫苗的本動物攻毒試驗提供適宜的攻擊毒株,并為我國狂犬病分子流行病學研究提供依據。鑒定結果如下。

1 材料與方法

1.1 病毒和血清 疑似狂犬病病犬腦組織,由廣西動物疫病預防控制中心提供;狂犬病病毒 Flury LEP株和狂犬病陽性血清,由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;犬瘟熱病毒(CDV)JL株,由中國農業(yè)大學劉維全教授提供;犬細小病毒(CPV)、犬腺病毒1型(CAV-1)、2型(CAV-2)和犬冠狀病毒(CCV),由北京世紀元亨動物防疫技術有限公司提供。

1.2 主要儀器設備及試劑 生物安全柜(德國Heraeus公司);PCR儀,BIO-RAD公司;DNA標準參照物DL-2 000和DL-5 000(北京全式金生物技術有限公司);DNA和RNA提取試劑盒及PCR試劑盒(天澤基因工程有限公司);FITC抗狂犬病病毒熒光單抗(Fujirebio Diognostics公司);狂犬病腦組織熒光染色標準陽性抹片,由軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所狂犬病及野生動物與人獸共患病診斷實驗室提供,陰性抹片由本實驗室制備;其他試劑均為國產分析純。

1.3 實驗動物 3日齡乳鼠及體重11～13 g清潔級昆明系小鼠、4月齡比格犬,購自北京實驗動物中心。

1.4 病毒分離及傳代 取狂犬病病犬腦組織,加PBS研磨,制成20%(W/V)乳劑,經除菌處理后,腦內接種乳鼠,0.03 mL/只。無菌采集接種后5～7 d瀕死乳鼠腦組織,制成20%(W/V)乳劑,連續(xù)傳3代,分別標記為F1、F2和F3。

1.5 電鏡觀察 用附有Formvar膜的銅網沾取犬腦組織及F3代鼠腦組織乳劑,用濾紙吸去多余液體,經2%磷鎢酸染色 1 min,用濾紙吸去染液,晾干后進行電鏡觀察。

1.6 中和試驗 取3代鼠腦組織乳劑,分別用PBS稀釋至10-2,與等量狂犬病陽性血清混勻,同時設未中和的病毒作對照。置37℃中和1 h后,分別腦內注射11～13 g小鼠10只,0.03 mL/只,觀察14 d,記錄小鼠發(fā)病死亡情況。

1.7 病毒含量測定 取3代鼠腦組織乳劑分別按現行《中國獸藥典》附錄進行檢測[1]。

1.8 本動物回歸試驗 取F3代乳劑肌肉注射狂犬病抗體陰性的比格犬8只,4.0 mL/只,觀察30 d,記錄犬發(fā)病、死亡情況。并取死亡犬腦組織進行直接熒光抗體染色(dFA)[2]。

1.9 N基因保守序列的擴增與分析 根據軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所提供的序列合成引物,RV-P1:5′-ATGTAACNCCTCTACAATGG-3′,RV-P2:5′-GCCCTGGT TCGAACA TTCT-3′,預期擴增片段大小為845 bp。按試劑盒說明書提取RNA,RT-PCR參照《分子克隆》[3]進行。對RTPCR產物進行序列測定,并采用DNAStar軟件,與GenBank發(fā)表的狂犬病病毒 CVS-11株、PV株、Flury LEP株以及ERA株的N基因進行比較。

1.10 分離株的純凈檢驗 按現行《中國獸藥典》[1]附錄進行細菌、真菌和支原體檢驗。采用 PCR或RT-PCR進行外源病毒的檢驗。其中根據劉維全教授提供的引物序列,合成了擴增犬瘟熱H蛋白基因保 守 序 列 的 引 物,CDV-P1:5′-CCTGGCCTCTGAGAAACAAG-3′;CDV-P2:5′-GAGTTCA AAAG TGG GCTTTC-3′,預期擴增片段大小為 224 bp。CPV、CAV-1、CAV-2和CCV檢驗的特異性引物均由北京世紀元亨動物防疫技術有限公司提供,分別擴增CPV的 VP2、CAV-1和CAV-2的 E3蛋白以及CCV的S蛋白基因保守序列,預期擴增片段大小分別為801 bp、520 bp、1 030 bp和372 bp。

2 結果

2.1 病毒分離 將狂犬病病犬腦組織經乳鼠腦內連傳3代,分離到狂犬病病毒,根據其來源,定名為GXLA(廣西隆安)株,每代均于接種后4 d開始發(fā)病,至6 d或7 d全部死亡。

2.2 電鏡觀察 對病犬腦組織和F3代病毒液進行電鏡觀察,可見子彈狀病毒粒子,大小約為70×150 nm,與文獻描述[4]基本一致,完整病毒粒子較多,包膜較光滑。

2.3 中和試驗 將3代病毒分別與狂犬病陽性血清中和后,注射的小鼠全部(10/10)存活,而對照組小鼠注射后4～6 d內全部發(fā)病死亡,表明待檢病毒可被狂犬病陽性血清中和。

2.4 病毒含量檢測 F1、F2和F3代病毒含量分別為104.0、104.17和 104.33LD50/0.03 mL,其中 F3 代病毒含量較高。

2.5 病毒回歸試驗 注射F3代病毒的8只犬均于第7天開始發(fā)病,出現不同程度的吞咽困難,流涎,脫舌,輕刺激易興奮,后軀麻痹直至四肢麻痹等狂犬病癥狀,至第9天全部死亡。取死亡犬腦組織進行dFA染色,均出現與陽性對照抹片一致的直徑小于1 μ m的沙粒樣狂犬病病毒特異性綠色熒光。

2.6 N基因保守序列的擴增與分析 分離株F1、F2和F3代均擴增出845 bp的條帶,與狂犬病病毒Flury LEP株一致。對F3代RT-PCR產物進行序列測定后,采用 DNAStar軟件,與GenBank發(fā)表的其他狂犬病病毒株進行同源性分析,結果與CVS-11株、PV株、Flury LEP株、ERA株的同源性分別為92.5%、92.5%、92.9%和 98.5%,同源性較高 ,符合狂犬病病毒N基因高度保守的特性,進一步表明分離的病毒為狂犬病病毒,結果見圖1。

圖1 狂犬病分離株N基因保守序列的擴增與分析

2.7 純凈檢驗

2.7.1 細菌、真菌和支原體檢驗 F1、F2和F3代病毒經硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(T.G)、酪胨瓊脂(G.A)和葡萄糖蛋白胨湯(G.P)培養(yǎng)5 d,均無細菌和真菌生長;經支原體液體培養(yǎng)基和瓊脂固體平板培養(yǎng)28 d,均無pH變化和支原體菌落生長。

2.7.2 外源病毒檢驗 F1、F2和F3代均未擴增出預期條帶,而CDV 、CPV 、CAV-1、CAV-2和CCV陽性對照分別擴增出 224 bp、801 bp、520 bp、1 030 bp和372 bp條帶,說明待檢分離株無以上病毒污染,見圖2。

圖2 外源病毒檢驗結果

3 討論

狂犬病是迄今為止人類惟一病死率高達100%的急性傳染病。該病病原為彈狀病毒科狂犬病病毒屬成員,狂犬病病毒屬可分為4個血清型或7個基因型。目前我國分離的狂犬病病毒均為血清1型或基因1型?？袢〔《净蚪M為不分節(jié)段的單股負鏈RNA,由11 928個核苷酸或11 932個核苷酸組成,含有5個大的ORF,編碼核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)和依賴 RNA 的RNA多聚酶(L)等5種結構蛋白[5]。由于核蛋白(N)具有高度保守性,因此常將其作為RV遺傳演化和分子流行病學研究的目標。在本研究中分離的狂犬病病毒GXLA株與狂犬病病毒CVS-11株、PV株、Flury LEP株、ERA株核蛋白(N)保守序列同源性在92.5%～98.5%,符合狂犬病病毒核蛋白高度保守的特性。

此次從廣西隆安分離的狂犬病街毒毒力較強,對犬致死率100%(8/8),是進行狂犬病滅活疫苗免疫攻毒試驗的理想毒株。目前我國狂犬病流行嚴重,以廣西、貴州等地多發(fā),且主要由犬引起,因此對狂犬病街毒株的分離鑒定,也有利于進一步開展狂犬病分子流行病學的研究,為我國狂犬病的防控、診斷以及免疫預防提供科學依據。

[1]中國人民共和國獸藥典委員會.中國人民共和國獸藥典三部(2005年版)[M].北京:中國農業(yè)出版社,2006.

[2]OIE.陸生動物診斷試驗和疫苗手冊(哺乳動物、禽鳥與蜜蜂)[M].世界動物衛(wèi)生組織.農業(yè)部獸醫(yī)局/中國動物衛(wèi)生與流行病學中心譯.5版.2004:287-290.

[3]薩姆布盧克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯T.分子克隆實驗指南[M].金冬雁,黎孟楓,譯.2版.北京:科學出版社,1992.

[4]殷震,劉景華.動物病毒學[M].2版.北京:中國農業(yè)出版社,1997.

[5]俞永新.狂犬病和狂犬病疫苗[M].2版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2009.