邱河輝,趙 娟,劉鳳華,朱曉宇,甘靜宜,王霞泰,許劍琴

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193;2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技系,北京昌平102206;3.農(nóng)業(yè)部獸用化藥和中草藥創(chuàng)制與評(píng)價(jià)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,北京海淀100193)

隨著養(yǎng)犬?dāng)?shù)量的快速增加,病毒性疾病嚴(yán)重威脅犬的健康。犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病病毒等誘導(dǎo)非炎性淋巴細(xì)胞程序性衰竭,侵入并破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)[1]。脾臟是機(jī)體外周免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所,抗原一旦進(jìn)入即可誘導(dǎo) T細(xì)胞和 B細(xì)胞的活化與增殖[2]。因此,開(kāi)發(fā)能增強(qiáng)犬抵抗病毒性疾病、增強(qiáng)脾臟免疫細(xì)胞功能的中獸藥很有研究意義。研究表明,黃芪多糖(APS)對(duì)機(jī)體非特異性免疫與特異性免疫有廣泛的影響,可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞活性[3],促進(jìn) IL-2、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌[4]。目前,APS對(duì)犬脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道,對(duì)犬免疫平衡的調(diào)節(jié)還有待深入研究。本研究用APS與ConA或LPS協(xié)同刺激犬脾淋巴細(xì)胞,觀測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá),探討APS對(duì)犬細(xì)胞免疫功能的影響,為其臨床應(yīng)用和保健品的開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 APS(批號(hào):HD006001,北京美迪克斯生物科技有限公司),RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào):NSG0059,?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司),Hank's Balanced Salt(批號(hào):ASD29233,?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司),淋巴細(xì)胞分離液(批號(hào):080712,灝洋生物公司),Trizol Reagent(批號(hào):1401902,Invitrogen),LPS(批號(hào):L2880,Sigma),ConA(批號(hào):C2631,Sigma),HEPES(批號(hào):0511,Amresco)。

1.2 犬脾淋巴細(xì)胞的采集 5月齡中華田園犬麻醉后放血致死,常規(guī)方法制備脾淋巴細(xì)胞[5]。細(xì)胞懸浮于RPMI-1640完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清,100 IU/mL 青霉素 、100 μ g/mL 鏈霉素 ,12 mmol/L HEPES(pH 7.1),0.05 mmol/L 2-巰基乙醇)。細(xì)胞懸液用0.3%臺(tái)盼藍(lán)染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)大于95%,最后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106cells/mL。1.3 犬脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 按參考文獻(xiàn)報(bào)道方法[6],對(duì)照組(CG)只加 1 mL完全培養(yǎng)基;ConA組加0.05 μ g/μ L ConA 300 μ L;LPS 組加 0.1 μ g/μ L LPS 300 μ L;APS 組 加 0.1 μ g/μ L APS 300 μ L;APS+ConA 組加 0.1 μ g/μ L APS 300 μ L 和 0.05 μ g/μ L ConA 300μ L;APS+LPS 組加 0.1 μ g/μ L APS 300 μ L 和 0.1 μ g/μ L LPS 300 μ L,各組加入2 mL細(xì)胞懸液,最后完全培養(yǎng)基補(bǔ)充至3 mL。每組6個(gè)重復(fù),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。

1.4 犬脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA表達(dá)

1.4.1 總RNA提取 細(xì)胞懸液吸至離心管中,1 500 r/min(4℃)離心 10 min,冷 PBS洗滌 1次。沉淀中加T rizol Reagent 1.0 mL,常規(guī)方法提取細(xì)胞總RNA,20 μ L DEPC水溶解。

1.4.2 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank網(wǎng)站公布的犬相關(guān)基因序列的CDs保守區(qū),用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)相關(guān)基因引物,其引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物為β-actin上游GGAACGCAAGTAT TC TGTG,下游 TCCCAACCCTGT TAGACC;IL-2 上游 ATCGCACTGACGCT TGTA,下游 AAACCT AGCACT TCCTCC;IL-12上游TTAGCAGCATC TATGAGGA,下游CAAGGGAGGATT TCTGTG;IFN-γ上游 GATGTATCGGACGGTGGG,下游GT TCATT TATCGCCT TGC;TNF-α上游CAGCCTCTTCTCCTTCCTC,下游 ACCCATCTGACGGCAC TA;IL-4上游 GCACTCACCAGCACCTTT,下游GCCGCAGTACAGTAGCAG

1.4.3 cDNA的合成及PCR擴(kuò)增 cDNA合成及PCR反應(yīng):反轉(zhuǎn)錄cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃5 min,94℃40 s,56.6℃(β-actin)、57.2℃(IL-2)、57.4℃(IL-12)、56.4℃(IFN-γ)、56.6℃(TNF-α)、57.6℃(IL-4)、40 s,72 ℃50 s,30個(gè)循環(huán)后,72℃自動(dòng)延伸10 min,4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.4.4 RT-PCR產(chǎn)物灰度分析及數(shù)據(jù)處理 凝膠成像和分析系統(tǒng)以目的基因IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ、TNF-α增量與內(nèi)對(duì)照β-actin擴(kuò)增量比值分別表示它們的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 APS協(xié)同ConA或 LPS刺激犬脾淋巴細(xì)胞Th1細(xì)胞因子mRNA表達(dá) 圖1顯示,與CG相比,APS可顯著(P＜0.05)提高 IL-2、IFN-γ和TFN-αmRNA的表達(dá);ConA促進(jìn)IFN-γ和TNF-α mRNA的表達(dá)(P＜0.05);APS+ConA顯著(P＜0.05)促進(jìn)IFN-γ、TNF-α和降低 IL-2 mRNA 的表達(dá);LPS顯著(P＜0.05)降低Th1型細(xì)胞因子mRNA的表達(dá);APS+LPS顯著(P＜0.05)降低IL-2、IL-12和TNF-αmRNA的表達(dá)。與ConA組比較,APS顯著(P＜0.05)提高IL-2和IFN-γmRNA的表達(dá);APS+ConA顯著(P＜0.05)促進(jìn)IL-12、IFN-γ和TNF-αmRNA的表達(dá)。與LPS組比較,APS顯著(P ＜0.05)促進(jìn) IL-2、IL-12、IFN-γ和TFN-αmRNA的表達(dá);APS+LPS顯著(P＜0.05)提高IFN-γ和 TNF-αmRNA的表達(dá)。

2.2 APS協(xié)同ConA或LPS刺激犬脾淋巴細(xì)胞IL-4 mRNA表達(dá) 圖 2表明,與 CG比較,IL-4 mRNA的表達(dá)ConA組和APS+ConA組顯著增加(P＜0.05),而LPS組和APS+LPS組顯著降低(P＜0.05)。與ConA組比較,APS+ConA組未見(jiàn)明顯變化。與 LPS組比較,APS組和APS+LPS組均顯著增加(P＜0.05),前者更加顯著。

3 分析與討論

CD4+T細(xì)胞可分為 Th1和 Th2兩個(gè)細(xì)胞亞群。Th1 細(xì)胞主要分泌 IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-12等細(xì)胞因子,主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答;Th2細(xì)胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和 IL-13等細(xì)胞因子,主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[7]。

本研究中以IL-2 、IL-12、IFN-γ和 TNF-α mRNA的表達(dá)代表Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)。圖1結(jié)果表明,APS對(duì)犬脾淋巴細(xì)胞 IL-2、IFN-γ和 TNF-α mRNA表達(dá)有顯著增強(qiáng)作用,促進(jìn) IL-2和IFN-γ mRNA表達(dá)的效果顯著優(yōu)于ConA,對(duì)IFN-γ和TNF-αmRNA的表達(dá)與ConA表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。這與前人報(bào)道的 APS能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的結(jié)果一致[4]。LPS對(duì)4種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)具有顯著抑制作用,APS能使它們的表達(dá)提高,表明APS具有介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的良好效果。

圖1 淋巴細(xì)胞Th1細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

值得注意的是,APS協(xié)同ConA促進(jìn)Th1類(lèi)IFN-γ和TNF-αmRNA的表達(dá)的同時(shí),IL-2 mRNA的表達(dá)相對(duì)較低。陳國(guó)友等人[8]報(bào)道,淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子(LFA-1)能抑制誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖,并抑制IL-2的分泌,而LFA-1僅作用于絲裂原活化脾淋巴細(xì)胞的早期。由此可見(jiàn),試驗(yàn)中IL-2 mRNA表達(dá)量的下降可能是APS協(xié)同ConA主要作用犬脾淋巴細(xì)胞活化的早期有關(guān)。

由圖2分析可見(jiàn),APS對(duì)犬脾淋巴細(xì)胞IL-4 mRNA表達(dá)沒(méi)有明顯影響;ConA及其與APS協(xié)同均可顯著增加其表達(dá),但是兩者之間未見(jiàn)顯著差異,表明APS與ConA的協(xié)同作用不明顯。LPS對(duì)IL-4 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)顯著抑制作用;APS及其與LPS協(xié)同能使其表達(dá)顯著高于LPS。說(shuō)明IL-4 mRNA表達(dá)抑制時(shí),APS能使其表達(dá)得到顯著提高,發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。

圖2 淋巴細(xì)胞IL-4 mRNA的表達(dá)

正常狀態(tài)下 Th1/Th2兩類(lèi)細(xì)胞因子處于平衡狀態(tài),以維持正常的免疫功能。有研究表明,當(dāng) T細(xì)胞在體外被激活時(shí),Th1參與的反應(yīng)常發(fā)生在早期,Th2細(xì)胞則隨著免疫應(yīng)答的進(jìn)展而增多[9],當(dāng)Th1類(lèi)細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)時(shí),促進(jìn)細(xì)胞免疫。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,APS能促進(jìn)犬脾淋巴細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子的表達(dá),APS與ConA有很好的協(xié)同性,APS能調(diào)節(jié)LPS對(duì)犬脾淋巴細(xì)胞的抑制作用。

4 結(jié)語(yǔ)

APS對(duì)犬脾淋巴細(xì)胞 IL-2、IFN-γ和 TNF-α mRNA表達(dá)有顯著增強(qiáng)作用,對(duì)IL-4 mRNA表達(dá)沒(méi)有明顯影響,當(dāng)上述相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)抑制時(shí),APS能使其表達(dá)得到顯著提高。

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