王 靜 ，石慶華 ，林嘉鵬 ，陳 博 ，汪立芹 ，趙云程 ，黃俊成

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)部家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)中心，烏魯木齊 830000）

許多研究證明，卵母細(xì)胞的核成熟和胞質(zhì)成熟對于受精后正常的胚胎發(fā)育是至關(guān)重要的［1］，尤其是對于體外胚胎生產(chǎn)、動(dòng)物克隆、轉(zhuǎn)基因、胚胎干細(xì)胞等胚胎生物技術(shù)的研究，胞質(zhì)的成熟直接關(guān)系到能否使供體核實(shí)現(xiàn)徹底的再程序化及重構(gòu)胚能否維持正常的分裂發(fā)育［2］。常用的鑒別卵母細(xì)胞質(zhì)量的方法，是根據(jù)包裹于卵母細(xì)胞上顆粒細(xì)胞的多少和緊密程度、卵母細(xì)胞質(zhì)色澤及均勻度等，但這種方法主觀性太強(qiáng)。Mangia等［3-4］通過對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖6磷酸脫氫酶（G6PDH）在生長中的卵母細(xì)胞中表現(xiàn)為活性狀態(tài)；處于生長期之后的卵母細(xì)胞中，其G6PDH顯著下降，而G6PDH活性的不同，亮甲酚藍(lán)染色（BCB）呈現(xiàn)不同程度的著色原理，篩選出細(xì)胞質(zhì)著藍(lán)色的卵母細(xì)胞為陽性組（BCB+），細(xì)胞質(zhì)不著藍(lán)色的為陰性組（BCB－），在對豬［5-7］、山羊［8-10］、牛［11-14］、鼠［15］、犬［16］的研究證實(shí)，BCB+卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)效率顯著高于BCB－卵母細(xì)胞,但很少見到BCB在綿羊卵母細(xì)胞上研究的報(bào)道。

卵母細(xì)胞發(fā)育過程中積累的母源mRNA及其編碼蛋白至少可支持從卵母細(xì)胞至1細(xì)胞胚胎期間的發(fā)育，同時(shí)這些母源物質(zhì)可能還參與合子基因組的激活，促使胚胎進(jìn)一步發(fā)育［17］，所以母源基因表達(dá)模式對于早期胚胎發(fā)育的重要性引起人們的關(guān)注。目前已發(fā)現(xiàn)大約100多種與小鼠早期胚胎發(fā)育相關(guān)的卵母細(xì)胞基因，但是研究透徹的還比較少［18］，尤其關(guān)于綿羊卵母細(xì)胞結(jié)合BCB染色的研究則更少。其中Mater、Zar1、Dnmt1和Gdf9四個(gè)母源基因是目前發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。Gdf9主要在哺乳動(dòng)物的卵巢卵母細(xì)胞中特異表達(dá)［19］，Gdf9基因敲除的小鼠，卵泡發(fā)育停滯在初級卵泡階段，使卵母細(xì)胞生長和減數(shù)分裂及顆粒細(xì)胞的分化受阻［20］；Mater是一種卵胞質(zhì)特異表達(dá)蛋白，Mater基因敲除后，小鼠胚胎發(fā)育阻斷在2細(xì)胞期［21］；Zar1在卵母細(xì)胞及小鼠1細(xì)胞期胚胎中大量表達(dá)，主要定位于胞漿，Zarl缺失的小鼠胚胎大多停留在1細(xì)胞期，且不能受孕［22］；Dnmt1是胚胎發(fā)生中保持基因甲基化的關(guān)鍵酶，Dnmt1失活對小鼠胚胎的發(fā)育有致命性影響［23］。

以往在對BCB篩選卵母細(xì)胞的研究中，通常只用體外培養(yǎng)的途徑證明其有效性，本文即通過檢測母源基因的表達(dá)差異，證明BCB對綿羊卵母細(xì)胞的篩選作用。從而判斷4種母源基因是否與卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟有關(guān)，為哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育分子機(jī)理的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 卵母細(xì)胞的獲取 本實(shí)驗(yàn)所用卵巢取自當(dāng)?shù)匾煌涝讏?，從半小時(shí)內(nèi)宰殺的綿羊體內(nèi)剪下卵巢，放入溫度為30℃左右的加有青霉素（1 000 u/mL）和鏈霉素（1 000 u/mL）的滅菌生理鹽水保溫杯內(nèi)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，卵巢用滅菌生理鹽水清洗3次，抽吸卵巢表面直徑為2～6 mm的卵泡，在顯微鏡下挑選出含有完整顆粒細(xì)胞層、胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞。（抽卵液成分為：TCM199-hepes（Sigma）+1mg/mL PVA（Sigma）+0.7 mg／mL 肝素鈉（Sigma）

1.2 BCB染色液 卵母細(xì)胞在38℃水浴內(nèi)用濃度為26μmol/L的亮甲酚藍(lán)染色液染色90min后，細(xì)胞質(zhì)著藍(lán)色的卵母細(xì)胞為陽性組（BCB+），細(xì)胞質(zhì)不著藍(lán)色的為陰性組（BCB-）。

1.3 卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng) 分級后的卵母細(xì)胞用成熟培養(yǎng)液洗滌3次，按20～30枚/滴的密度將卵母細(xì)胞放入覆蓋礦物油（Sigma）的50μL成熟液滴，在38.6℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。

成熟培養(yǎng)液的成分為TCM199-HCO3（Sigma）+10%FBS（v/v）（GIBCO）+0.05 u/mL FSH（Sigma）+0.05u/mL LH（Sigma）+1μg/mL estradiol （Sigma）+24.2mg/L sodium pyruvate（Sigma）+0.1mM cysteamine （Sigma）+10 ng/mL EGF（Sigma）。

1.4 卵母細(xì)胞體外受精 將體外成熟24h的卵母細(xì)胞在0.1%透明質(zhì)酸酶液內(nèi)輕輕吹吸，除去大部分顆粒細(xì)胞，用受精液充分洗滌3次后，按20～30枚/滴的密度放入平衡好的50μL受精液滴內(nèi)。

使用上游方法分離精子。從液氮內(nèi)取出凍精放入39℃水浴內(nèi)試管中解凍，把解凍的精液等分輕輕加入已平衡好的裝有0.5mL受精液的兩個(gè)離心管底部，放入38.6℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中上游20 min，按2×106個(gè)/mL的精子密度將稀釋好的精子混懸液加入受精液滴，與卵母細(xì)胞在38.6℃、5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)共同孵育18h。

受精液成分為：SOF+20%發(fā)情羊血清+6 u/mL肝素鈉+100 u/mL慶大霉素。

1.5 胚胎體外培養(yǎng) 體外受精18h后，在胚胎培養(yǎng)液內(nèi)用小口徑吸管輕輕吹吸假定受精胚，脫去顆粒細(xì)胞，洗滌3次后，將50～80枚胚胎放入500μL培養(yǎng)液的四孔板內(nèi)，在 38.6℃、5%CO2、5%O2，90%N2、飽和濕度的密封氣袋內(nèi)培養(yǎng)。

1.6 卵母細(xì)胞總RNA提取與RT-PCR 將收集的卵母細(xì)胞用 PBS（GiBco without Ca2+、Mg2+）洗 3 遍，放入 DEPC水處理過的1.5mL離心管中，10 000 r/min離心1 min，小心吸去上清液，按照RNeasy Micro Kit（QIAGEN）試劑盒介紹的方法提取卵母細(xì)胞總RNA。

RT-PCR體系：將1μg總RNA與1μL隨機(jī)六聚物引物混合后，RNase free water補(bǔ)足至 14.5μL，70℃ 10 min，冰浴 10 min，瞬時(shí)離心后加入 RNA inhibitor 0.5μL，5 ×buffer2μL，10mmol/L dNTP 2μL，AMV 1μL（TaK aRa），42 ℃ 40 min。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別把Mater、Zar1、Dnmt1、Gdf 9基因和18S rRNA與pMD20-T載體進(jìn)行連接，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ將各個(gè)基因的質(zhì)粒線性化，并將各個(gè)基因線性化的質(zhì)粒進(jìn)行濃度稀釋后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別根據(jù)GeneBank 中綿羊 Mater、Zar1、Dnmt1、Gdf 9和18S rRNA序列，用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)上述基因的PCR擴(kuò)增的上下游引物。

表1 實(shí)時(shí)定量引物序列

1.8 Quantitative RT-PCR檢測 Quantitative RT-PCR反應(yīng)體系：2 μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和樣品cDNA，上下游引物各5 pM，2 ×FastStart DNA Master SYBR Green I 10 μL（QIA GEN），加 RNase free water至 20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，55個(gè)循環(huán)中包括95℃10 s，60℃20 s以及72℃20 s。熔解曲線從40～99℃，每秒增加2℃，并收集熒光信號。為減小誤差，將quantitative RT-PCR重復(fù)一次，以平均值參與分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 體外培養(yǎng)成熟率：BCB染色后經(jīng)體外培養(yǎng)排出第一極體的卵母細(xì)胞數(shù)占總卵母細(xì)胞數(shù)的百分比統(tǒng)計(jì)為體外培養(yǎng)成熟率。數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

卵裂率：BCB染色后的卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精后，發(fā)生卵裂的卵母細(xì)胞數(shù)占總卵母細(xì)胞數(shù)的百分比記為卵裂率。數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

囊胚率：受精當(dāng)天設(shè)為第0天，第7天統(tǒng)計(jì)囊胚率（囊胚數(shù)/卵數(shù)）。數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

根據(jù)LightCycler1.5軟件給出的相對定量表達(dá)結(jié)果，利用SAS 9.0軟件，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 BCB篩選對體外培養(yǎng)效率的影響 表2顯示了BCB篩選后的卵母細(xì)胞體外成熟率、受精率及后期發(fā)育率的差異。BCB+卵母細(xì)胞成熟率、卵裂率、囊胚率依次為86.16%、85.29%、34.4%，分別高于BCB-卵母細(xì)胞組的50.94%、36.19%、6.73%，差異極顯著（P＜0.01）。

表2 經(jīng)BCB選擇的卵母細(xì)胞體外受精后發(fā)育率的比較（重復(fù)3次）

2.2 經(jīng)BCB篩選后的卵母細(xì)胞中Gdf9、Mater、Zar1、Dnmt1基因表達(dá)水平的變化 從圖1可知，4個(gè)母源基因趨勢一致，經(jīng)亮甲酚藍(lán)染色篩選后的陽性卵母細(xì)胞母源mRNA相對表達(dá)量比陰性的低（P＜0.01）。

圖1 經(jīng)BCB篩選的BCB-卵母細(xì)胞和BCB+卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)24h后母源基因mRNA表達(dá)量的差異

3 討論

卵母細(xì)胞體內(nèi)外成熟過程中最主要的差異是成熟環(huán)境的不一致，這種不一致可能會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟度出現(xiàn)差異，最終影響受精結(jié)果和胚胎發(fā)育能力。而卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)成熟是體外受精和早期胚胎發(fā)育所必需的。在體內(nèi)成熟時(shí)，卵泡對核成熟提供抑制因子，如卵母細(xì)胞成熟抑制因子（OMI）、環(huán)腺一膦（cAMP）、嘌呤及其衍生物，從而使得核成熟和胞質(zhì)成熟之間存在著最佳的平衡，核成熟與胞質(zhì)成熟同步［24］，這種同步化對卵母細(xì)胞的囊胚發(fā)育潛能起非常重要的作用。但在體外培養(yǎng)時(shí)，卵母細(xì)胞離開了卵泡的抑制環(huán)境，核質(zhì)成熟出現(xiàn)了不同步，細(xì)胞核成熟的完成并不能保證細(xì)胞質(zhì)的完全成熟，從而影響卵母細(xì)胞后期發(fā)育，并且降低卵裂率和囊胚率。本實(shí)驗(yàn)利用BCB染色，通過卵母細(xì)胞胞質(zhì)中葡萄糖6磷酸脫氫酶（G6PDH）在成熟卵母細(xì)胞和未成熟卵母細(xì)胞胞質(zhì)的活力來檢測卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟情況，從而觀察這4種母源基因在卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟與未成熟時(shí)的表達(dá)差異。通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，這4種母源基因在陰性實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量極顯著高于陽性實(shí)驗(yàn)組（P＜0.01）。

通過BCB染色原理我們可以知道，BCB+組中的胞質(zhì)是成熟的，即在生長期間，各種類型的RNA合成旺盛，并進(jìn)行蛋白質(zhì)積累，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄已完成，在體外具有自發(fā)核成熟能力，而BCB-組中的卵母細(xì)胞可能來源于小卵泡［25］。雖然在體內(nèi)有一部分RNA的合成，但未能適時(shí)適量地合成某些參與調(diào)控成熟分裂恢復(fù)的有關(guān)蛋白因子，故此卵母細(xì)胞的胞質(zhì)是未成熟的。由此可知BCB+的卵母細(xì)胞由于胞質(zhì)已經(jīng)具備自發(fā)核成熟能力，所以BCB+的實(shí)際成熟時(shí)間要短于BCB-，由于卵母細(xì)胞成熟一旦結(jié)束，則母源RNA就開始降解［26］。這與Wang Q等［27］研究早期胚胎中的轉(zhuǎn)錄因子（母源性蛋白）在卵母細(xì)胞成熟過程中其含量的變化模式一致。本實(shí)驗(yàn)在研究這4種母源 mRNA（Mater、Zar1、Gdf9、Dnmt1）在綿羊卵母細(xì)胞及早期胚胎中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著卵母細(xì)胞的成熟和胚胎的發(fā)育，表達(dá)量逐漸降低［28］，而且綿羊卵母細(xì)胞的質(zhì)量與這4種母源基因的表達(dá)量成反比。所以兩者都成熟24h時(shí)，BCB+組比BCB-組卵母細(xì)胞的母源基因要降解的多，BCB-組比BCB+組的母源基因含量高，并且差異極顯著（P＜0.01）。

綜上所述，通過檢測母源基因的表達(dá)差異，可證明BCB對綿羊卵母細(xì)胞篩選這一方法的可行性和可靠性。從而也可判斷4種母源基因與卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟有關(guān)，為哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育分子機(jī)理的研究提供參考。

［1］Krisher R L，Bavister B D.Responses of oocytes and embryos to the culture environment［J］.Theriogenology，1998，49：103-114.

［2］Fair T，Hyttel P，Greve T.Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity［J］.Mol Reprod Dev，1995，42（4）：437-442.

［3］Mangia F，Epstein C J.Biochemical studies of growing mouse oocytes：preparation of oocytes and analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase and lactate dehydrogenase activities［J］.Dev Biol，1975，45（2）：211-20.

［4］Yanagimachi R，Knobil E，Neill J D.The physiology of reproduction［M］.New York：Raven press，1988：135-85.

［5］Ericsson S A，Boice M L，F(xiàn)unahashi H，et al.Assessment of porcine oocytes using brilliant cresyl blue［J］.Theriogenology，1993，39：214.

［6］Roca J，Martí nez E，Vázquez J M，et al.Selection of immature pig oocytes for homologous in vitro penetration assays with the brilliant cresyl blue test［J］.Reprod Fertil Dev，1998，10：479-85.

［7］Shahinaz H El Shourbagy，Emma C Spikings，Mariana Freitas，et al.Mitochondria directly influence fertilisation outcome in the pig［J］.Reproduction，2006，131：233-245.

［8］E Rodrí guez-González，M Lá pez-Béjar，E Velilla，et al.Selection of prepubertal goat oocytes using the brilliant cresyl blue test［J］.Theriogenology，2002，57：1397-1409.

［9］Elisabeth Rodríguez-González，Manel López-Bejar,Dolors Izquierdo，et al.Developmental competence of prepubertal goat oocytes selected with brilliant cresyl blue and matured with cysteamine supplementation［J］.Reprod Nutr Dev，2003，43：179-187.

［10］Aixa Urdaneta，Ana-Raquel Jiménez-Macedo，Dolors Izquierdo，et al.Supplementation with cysteamine during maturation and embryo culture on embryo development of prepubertal goat oocytes selected by the brilliant cresyl blue test［J］.Zygote，2003，11：347-354.

［11］Marc Pujol，Manel Lopez-Bejar，Maria-Teresa Paramio.Developmental competence of heifer oocytes selected using the brilliant cresyl blue（BCB）test［J］.Theriogenology，2004，61（4）：735-744.

［12］H Alma，H Torner，B Lo hrkea，et al.Bovine blastocyst development rate in vitro is influenced by selection of oocytes by brillant cresylblue staining before IVM as indicator for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity［J］.Theriogenology，2005，63：2194-2205.

［13］S Bhojwani，H Alm，H Tomer，et al.Se lection of devel opmentally competentoocytesthrough brilliantcresylblue stain enhances blastocystdevelopmentrate afterbovine nucleartransfer［J］.Theriogenology,2007,67：341-345.

［14］B M Manjunatha，P S P Gupta，M Devaraj，et al.Selection of developmentally competent buffalo oocytes by brilliant cresyl blue staining before IVM［J］.Theriogenology，2007，68：1299-1304.

［15］Wu Y G，Liu Y，Zhou P et al.Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining：a study using the mouse model［J］.Cell Res，2007，17（8）：722-31.

［16］B A Rodrigues，P Rodriguez，AEF Silva，et al.Preliminary study in immature canine oocytes stained with brilliant cresyl blue and obtained from bitches with low and high progesterone serum profiles［J］.Reproduction in Domestic Animals，2009，44（2）：255-258.

［17］Elis S,Batellier F，Couty I.Search for the genes involved in oocyte maturation and early embryo development in the hen［J］.BMC Genomics，2008，9：110.

［18］Wilmut l，schnieke A E，McWhir J.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells［J］.Nature，1997，385：810-813.

［19］Fitzpatrick S L,Sindoni D M，Shughrue P J.Expression of growth differ entiation factor-9 messenger ribonucleic acid in ovarian and nonovar ian rodentand human tissues［J］.Endocrinology,1998,139（5）：2571-2578.

［20］Takahashi Y,First N.In vitro development of bovine one cell embryos：influenceofglucose，lactate，pyruvate，aminoacidsand vitamins［J］.Theriogenology，1992，37：963-978.

［21］Tong Z B，Gold L，Pfeifer K E.Mater，a maternal effect gene required for early embryonic development in mice［J］.Nat.Genet，2000，26（3）：267-268.

［22］Wu X，Viveiros M，Eppig J J.Zygote arrest 1（Zar1）is a novel maternal-effect gene critical for the oocyte-to-embryo transition［J］.Nat Genet，2003，33（2），187-191.

［23］張瑩，張秋芳，劉平.母性效應(yīng)基因 Mater、Zarl的結(jié)構(gòu)與功能［J］.生殖與避孕，2009,29（1）：59-63.

［24］Nogueira D，Cortvrindt r，De Matos D D，et al.Effect of phosphodiesterase type 3 inhibitor on developmental comptence of immature oocytes in vitro［J］.Biol Reprod，2003，69：2045-2052.

［25］Yoon K W，Shin T Y，Park J I，et al.Development of porcine oocytes from preovulatory follicles of different sizes after maturation in media supplemented with follicular fluids［J］.Reprod Fertil Dev，2001，12（4）：133-139

［26］Sehult Z R M.Regulation of zygotic gene activation in the mouse［J］.Bioessays，1993，15（8）：531-538.

［27］Wang Q，Latham K E.Translation of maternal messenger ribonucleic acids encoding transcription factors during genome activation in early mouse embryos［J］.Biol Reprod，2000，62（4）：969-978.

［28］侯敏，林嘉鵬，黃俊成.母源基因 Gdf9，Zar1，Mater，Dnmt1 mRNA在綿羊卵母細(xì)胞和早期胚胎中的表達(dá)［J］.中國草食動(dòng)物，2010，30（2）：5-10.