趙 靜 ，張立嶺 ，2，巴 圖

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018；2.海南大學動物科學系，?？?570228；3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學院畜牧研究所）

在哺乳動物胚胎早期，從受精到8細胞時期，真核基因組DNA是去甲基化的。從8細胞時期到桑椹胚，基因組DNA開始進行甲基化。在囊胚時期，完成甲基化。這個過程稱為表觀遺傳修飾。DNA甲基化是DNA在復制后由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyl-transferase,Dnmt）催化，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶第5位的碳原子上而形成5-甲基胞嘧啶（5mC）［1］。胞嘧啶容易發(fā)生甲基化，單個的甲基化胞嘧啶具有高度的自發(fā)性突變的趨勢。胞嘧啶第5位碳原子的甲基化，不改變DNA分子的雙螺旋構(gòu)型[2]，也沒有改變這種規(guī)律或者產(chǎn)生新的排列限制。DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)錄時，由于解旋和解鏈，而不再存在大溝小溝的三級結(jié)構(gòu)。許多實驗證明，如果沒有經(jīng)歷正常的DNA甲基化過程，動物胚胎不能正常發(fā)育?；蛱蕹?、轉(zhuǎn)基因以及體細胞克隆生成的胚胎常常會在囊胚時期死亡，或者出生后發(fā)育異常，包括巨大胎兒、生長過快及早死等現(xiàn)象［1］。

哺乳動物的Homeobox基因的1～3表達位置在頭部枕骨區(qū)，4～6在頸椎區(qū)（包括第一胸椎），7～9在胸腰區(qū)，10～11在腰薦區(qū)，12～13在薦尾區(qū)。基因Knockout實驗證明，鼠的Hoxc-8突變可使胸椎增加一個，隨之肋骨也多生一對［3］。Hoxd11突變則導致鼠的腰椎或薦椎增加一枚［4］。

世界各地的大多數(shù)綿羊品種，除了頸椎都是7枚以外，胸、腰椎數(shù)目以13+6組合為主，13+7和14+6組合型少見，14+7組合極少見。但是，蒙古羊與其它品種綿羊不同，胸、腰椎的數(shù)目多見13+7和14+6組合型，14+7組合型也達到5%左右。這種胸腰椎數(shù)的變異，以非孟德爾方式遺傳。公羊的胸腰椎數(shù)對后代的影響最明顯，而母羊的多胸腰椎性狀對后代沒有影響。最近的研究表明，不同品種綿羊胸椎和腰椎數(shù)目的變異，與動物的主軸骨發(fā)育的調(diào)控基因homeobox C8和homeobox D11第一外顯子序列的胞嘧啶甲基化的數(shù)量和位置有關(guān)，這兩個基因是否表達，取決于基因來自父系，還是來自母系。其遺傳規(guī)律和表達方式具有明顯的表觀遺傳特征[5]。

關(guān)于胞嘧啶甲基化對基因功能的影響，過去有人認為，由于胞嘧啶第5位碳原子的甲基化，導致在甲基周圍形成局部的疏水區(qū)，這一區(qū)域擴伸到B-DNA的大溝中，使B-DNA→Z-DNA。即胞嘧啶的甲基化改變了DNA分子的構(gòu)型，使基因的轉(zhuǎn)錄停止［2］。但是，這個推測是不成立的。因為胸腺嘧啶第5位碳原子同樣有一個甲基，單鏈DNA上的4種堿基排列是多種多樣的，并無限制。

胞嘧啶的甲基化，無論從DNA的二維還是三維空間來看，都沒有改變這種規(guī)律或者產(chǎn)生新的排列限制。而且DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)錄時，由于解旋和解鏈，而不再存在大溝小溝的三級結(jié)構(gòu)，所以，胞嘧啶甲基化在結(jié)構(gòu)上沒有改變DNA雙螺旋的構(gòu)型?；蛐蛄兄械陌奏ぜ谆纳飳W功能，無疑存在其他的機制。

研究證明蒙古羊14枚胸椎與Hoxc8基因的第一外顯子甲基化有關(guān)，通過對該基因甲基化的定量檢測，可以早期鑒別多胸椎個體［5］。蒙古羊Hoxc8 exon-1的堿基序列中，沒有可能導致Z-DNA構(gòu)象的CpGpCpGp［3］或ACACACAC序列，不存在具有免疫性或特異性很強的Z-DNA抗體。鑒于Hoxc8 exon-1的甲基化確實與蒙古羊多胸椎性狀有關(guān)，本研究利用同樣的思路和技術(shù)，分析Hoxd11 exon-1的CpG位點的分布特征，探索以蒙古羊Hoxd11 CpG特征為分子標記，早期識別和選擇多腰椎個體。在此基礎(chǔ)上，進一步分析Hoxd11 exon-1甲基化特征，為進一步闡釋蒙古羊多胸椎性狀的分子遺傳機制，并且應用于多脊椎個體育種提供高新技術(shù)支持。

1 材料和方法

2007—2010年分3批，每批采集200只純種成年蒙古羊血樣，檸檬酸抗凝，液氮凍存。羊群來采自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟的東烏珠穆沁旗。用Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega，A1120） 提取蒙古羊基因組DNA。參考NCBI的GenBank相近物種的相應基因序列設(shè)計PCR引物，擴增目標序列。測序后，與已知物種序列比對，確認目標基因及其外顯子和內(nèi)含子，CpG的數(shù)量、位置、比例等。

由于在PCR實驗條件摸索和弩表序列的引物篩選過程中，發(fā)現(xiàn)蒙古羊Hoxd11序列exon-1中CpG數(shù)量多，密度高，導致目標序列的PCR困難，因此，本實驗專門設(shè)計了針對高CpG序列的PCR引物以及專門的PCR擴增條件。

Hoxd11全長擴增引物：上游引物：5'-CTCTTGTGCAATCGATGGCTCAGGT-3'；下游引物：5'-CAAAAACAAGTGCCTTCCAGCCC-3'。該引物的擴增產(chǎn)物長度2 197bp，覆蓋整個目標基因。

2 結(jié)果

目標序列PCR擴增及測序結(jié)果表明，蒙古羊Hoxd11基因全長 1 772 bp，其中 exon-1 為 778 bp（見圖 1），exon-2為236 bp，內(nèi)含子為758 bp。該基因的全序列已提交 NCBI GenBank，編號（Accession No）為 GU059862。

圖1 Hoxd11全長PCR擴增產(chǎn)物

Hoxd11 exon-1序列的CpG數(shù)：共有120個CpG；A，G，C，T的比例分別為12.72%、38.82%、37.92%、10.54%。Hoxd11 exon-2序列的CpG數(shù)：共有12個CpG。

由于Hoxd11 exon-1的CpG主要位于exon-1，而exon-2中的CpG極少，而且分布分散，所以，本文重點討論Hoxd11 exon-1的CpG位點的分布。

在Hoxd11 exon-1的120個CpG中，位于遺傳密碼第1～2位的CpG共8個，編碼一種氨基酸（精氨酸，R）。位于密碼的第2～3位的CpG共47個，占所有CpG的39.17%（47/120），分別編碼絲氨酸（S）5個，脯氨酸（P）18個，蘇氨酸（T）2個，丙氨酸（A）22個。由于其余的65個CpG中的堿基C與G分別位于相鄰的2個密碼中，在轉(zhuǎn)錄翻譯過程中互不相干，故從略。

圖2 蒙古羊Hoxd11 exon-1及其氨基酸序列

3 討論

在蒙古羊Hoxd11序列中，與Hoxc8的exon-1相似[5]，exon-1的CpG含量和分布密度大大高于exon-2。例如，Hoxd11 exon-1 CpG 的比例 30.85%（120×2/778），exon-2 CpG 的比例 10.17%（12×2/236）。Hoxd11 exon-1的 G+C含量為76.74%，高于A+T的含量（23.26%），其中CpG中的G+C含量30.85%。與Hoxc8 exon-1的堿基序列相似，Hoxd11 exon-1的堿基序列中，也沒有可能導致Z-DNA構(gòu)象的CpGpCpGp序列，或ACACACAC序列［6］，因此同樣不存在具有免疫性或特異性很強的Z-DNA抗體［7］。由于小鼠的Hoxc8和Hoxd11基因的敲除實驗證明，這兩個基因調(diào)控胸腰椎的發(fā)育和數(shù)量變異，多胸椎（T14）與正常胸椎數(shù)（T13）的蒙古羊只在Hoxc8的exon-1序列的甲基化上存在差異，所以，可以推斷，Hoxd11 exon-1的CpG甲基化的分布和數(shù)量差異，很可能是腰椎數(shù)量變異的原因。

由于DNA堿基序列中的甲基化胞嘧啶無論在三維結(jié)構(gòu)上還是在分子軌道參數(shù)上，都沒有達到改變DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)或造成DNA復制障礙的程度，所以，胞嘧啶甲基化的生物學功能最有可能在DNA→RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯階段起作用，即改變轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或翻譯結(jié)果。甲基化胞嘧啶（5mC）分子的電子數(shù)比C分子多7個，所以5mC比C具有更高的電子密度，因此也具有比C更高的基態(tài)能量?；虻男畔▔A基的分子結(jié)構(gòu)及其包含的電子信息和能量信息。這些信息具有穩(wěn)定性和傳遞性，特異性和相干性，其表達與否，取決于來源父系還是母系。

在相同基因的同一密碼中相同位置的胞嘧啶，其中一個未甲基化，另一個甲基化，在翻譯過程中產(chǎn)生不同的氨基酸，這種差異用堿基結(jié)構(gòu)差異無法解釋，所以，必須從新的角度尋找其中的奧秘。密碼和反密碼配對時主要是堿基分子之間的3個氫鍵之間的結(jié)合，未參與這3個氫鍵形成的第5位的甲基究竟起了什么作用，這需要根據(jù)量子生物學知識，特別是胞嘧啶與甲基化胞嘧啶的分子軌道的多種能量系統(tǒng)的計算結(jié)果來確定。關(guān)于甲基化胞嘧啶的作用機理，目前，根據(jù)分子軌道理論計算結(jié)果［8］和甲基化序列分析［5］表明，一是取決于甲基化胞嘧啶分子處于基態(tài)還是處于激發(fā)態(tài)；二是胞嘧啶的甲基化是提高了還是降低了密碼—反密碼的相互識別標準；三是甲基化胞嘧啶在基因的第一外顯子中的數(shù)量和排列的密集度；四是甲基化胞嘧啶位于第一外顯子中的三聯(lián)密碼的第幾個位置。這4種因素又決定了密碼中的甲基化胞嘧啶與反密碼識別的特異性，從而導致密碼與反密碼選擇與胞嘧啶不同的氨基酸。

在掌握了蒙古羊Hoxd11 exon-1的CpG位點分布特征以后，下一步就是分析這些CpG中的甲基化位點，分布密度及其與蒙古羊多腰椎性狀之間的關(guān)系。根據(jù)目前的實驗結(jié)果（另文發(fā)表）可以預測，蒙古羊腰椎數(shù)（6個與7個）的差異，與Hoxd11 exon-1的CpG甲基化位點的數(shù)量和密度差異是相對應的。這種甲基化差異極有希望成為多腰椎個體的分子遺傳標記，在早期選種中應用，成為提高肉羊產(chǎn)肉性能的新技術(shù)。

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