培養(yǎng)基組成對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?/h1>
2010-06-04 08:09王霞,劉麗華,張霞等
化學(xué)與生物工程 2010年4期
氨基酸的制備方法有蛋白質(zhì)水解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法等，其中化學(xué)合成法因成本低、適于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)而獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。但市場(chǎng)大量需要的是單一構(gòu)型的氨基酸，而化學(xué)合成法得到的產(chǎn)物為外消旋混合物，必須通過(guò)手性拆分才能得到單一構(gòu)型的產(chǎn)品。高效、綠色、安全的氨基酰化酶法是拆分氨基酸的最佳方法之一，目前人們主要應(yīng)用該方法拆分化學(xué)合成法生產(chǎn)的氨基酸DL-消旋體。
氨基?；赣址QN-?；被醽啺坊饷富蝓；?，是一類能夠水解N-?；?DL-氨基酸上酰胺鍵的酶。具有光學(xué)異構(gòu)專一性，能夠選擇性地水解N-?；?DL-氨基酸[1]，通過(guò)分離即可得到光學(xué)純L-或D-氨基酸。因此，高活力和高立體選擇性的氨基酰化酶的生產(chǎn)菌株的選育和產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，是高效、低成本制備氨基酸的基礎(chǔ)。
氨基?；傅膩?lái)源很廣，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的氨基?；笍V泛存在于各種動(dòng)植物的器官內(nèi)、微生物胞內(nèi)或發(fā)酵液中。氨基酰化酶的制備方法有動(dòng)植物組織提取法和微生物發(fā)酵法，由微生物發(fā)酵法制備的氨基?；副葎?dòng)植物提取法制備的更穩(wěn)定、更經(jīng)濟(jì)、底物專一性更強(qiáng)。
目前，用于氨基酸拆分的氨基?；复蠖嘤擅浊拱l(fā)酵得到。 雖然氨基?；覆皇敲浊沟闹饕赶担捎谄渖L(zhǎng)速度快、酶活性高、底物專一性強(qiáng)，尤其適于α-氨基和羥基消旋物特別是外消旋氨基酸的大規(guī)模拆分。因此，由米曲霉發(fā)酵制備大量高活性的氨基?；笇?duì)化工產(chǎn)品的后續(xù)加工非常重要。
作者在此對(duì)誘變而得的最優(yōu)米曲霉菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，探求從外界環(huán)境進(jìn)一步提高米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶的能力，以使氨基?；傅漠a(chǎn)量和質(zhì)量達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的需求，為工業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
1 實(shí)驗(yàn)
1.1 材料、試劑與儀器
米曲霉菌株,實(shí)驗(yàn)室誘變所得；麩皮，自購(gòu)。
N-乙酰-DL-蛋氨酸，張家港市華昌藥業(yè)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
SHZ-82型氣浴恒溫振蕩器，721型可見(jiàn)分光光度計(jì)，YXQG02型手提式電熱壓力蒸汽消毒器，SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，各種玻璃器皿。
1.2 培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，切塊煮沸30 min，過(guò)濾得清液，自來(lái)水補(bǔ)足1000 mL，加入葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，pH值自然，1×105Pa滅菌30 min。
初始發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮0.6 g，蛋白胨0.6 g，硫酸鎂0.03 g，磷酸二氫鉀0.06 g，水30 mL，pH值自然，1×105Pa滅菌30 min。
1.3 方法
1.3.1 斜面培養(yǎng)
接種PDA斜面，于30℃培養(yǎng)4 d，產(chǎn)生大量綠色孢子。
1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)
用無(wú)菌水分2次洗下斜面上的孢子，在玻璃珠三角瓶?jī)?nèi)150 r·min-1振蕩15 min，制得孢子懸液。接種3 mL孢子懸液于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、150 r·min-1培養(yǎng)48 h,收獲培養(yǎng)物。發(fā)酵液抽濾,將菌絲體用蒸餾水沖洗3次,抽干,稱重。
1.4 酶活測(cè)定
取1 g菌體放入100 mL三角瓶中，加入pH值7.0的磷酸緩沖溶液10 mL、0.2 mol·L-1的N-乙酰-DL-蛋氨酸溶液10 mL，于37℃、150 r·min-1搖床振蕩1 h，過(guò)濾，濾液在水浴中煮沸10 min，使酶失活。
采用茚三酮顯色法測(cè)定拆分出的L-蛋氨酸的物質(zhì)的量(mmol·L-1)：將上述濾液稀釋一定倍數(shù)，取稀釋后濾液1 mL，加入pH值5.4的2 mol·L-1醋酸緩沖溶液1 mL和茚三酮顯色液1 mL，混勻后于沸水浴中加熱15 min，自來(lái)水冷卻放置5 min后，加入3 mL60%乙醇稀釋，搖勻后用721型分光光度計(jì)測(cè)定OD570。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)液L-蛋氨酸的物質(zhì)的量。
酶活定義[2]：在37℃、pH值為7.0的條件下，1 g濕菌體1 h拆分所產(chǎn)生的L-蛋氨酸的微摩爾數(shù)。
根據(jù)下式計(jì)算酶活:
式中：C為L(zhǎng)-蛋氨酸的物質(zhì)的量，mmol·L-1；V為酶促反應(yīng)的總體積，L(本實(shí)驗(yàn)為0.02 L)；N為稀釋倍數(shù)；t為搖瓶時(shí)間，h(本實(shí)驗(yàn)為1 h)；M為濕菌絲用量，g(本實(shí)驗(yàn)為1 g)；1000為μmol與mmol的換算基數(shù)。
2 結(jié)果與討論
2.1 碳源及其含量的選擇
固定培養(yǎng)基的其它條件不變，考察碳源對(duì)米曲霉菌株產(chǎn)氨基?；傅挠绊?，結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 碳源對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶的影響
從圖1可看出，碳源對(duì)氨基?；傅拿富钣绊懞艽?。以葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉作為碳源時(shí)，氨基酰化酶的酶活很低；以麩皮為碳源時(shí)，酶活最高；以乳糖或CMC作碳源時(shí),酶活很高,但菌體量很低。這可能是因?yàn)?，麩皮不但可以提供菌體生長(zhǎng)所需的碳水化合物,而且其含有的微量因子可能對(duì)氨基?；傅漠a(chǎn)生有促進(jìn)作用，同時(shí)麩皮能增強(qiáng)培養(yǎng)基的通透性，利于好氧菌的生長(zhǎng)[3～5];而以乳糖和CMC作為碳源時(shí)，由于菌體大量產(chǎn)酶的同時(shí)影響了菌體本身的生長(zhǎng)，所以盡管酶活很高，但菌體量很低，而且用CMC作為碳源的發(fā)酵液極其粘稠，不易分離。因此，選擇麩皮為適宜的碳源。
以麩皮為碳源，考察其含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?，結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 麩皮含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶的影響
從圖2可看出，麩皮含量為1.5%時(shí)，氨基?；傅拿富钭罡?；隨著麩皮含量的增加，菌體量明顯增加，酶活反而下降。這可能是麩皮中某種微量元素的增加造成的，該元素可能特異性促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，而不促進(jìn)或者抑制酶的分泌。
2.2 氮源及其含量的選擇
固定培養(yǎng)基的其它條件不變，考察氮源對(duì)米曲霉菌株產(chǎn)氨基酰化酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 氮源對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?/p>
從圖3可看出，選用無(wú)機(jī)氮源時(shí)氨基?；傅拿富钶^低，而有機(jī)氮源大多能提高氨基?；傅拿富睿渲心蛩貫榈磿r(shí)的酶活最高。因此，選擇尿素為適宜的氮源。
陳曦等[6]報(bào)道,培養(yǎng)基的不同成分可誘發(fā)產(chǎn)生不同的酶；孫春華等[7]報(bào)道，尿素對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶的影響很??；從本實(shí)驗(yàn)可看出，尿素對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶有很大的影響。以尿素為氮源，考察其含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?，結(jié)果見(jiàn)圖4。
圖4 尿素含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?/p>
從圖4可看出，當(dāng)尿素的含量為1.5%時(shí)，米曲霉產(chǎn)氨基?；傅拿富钭罡?。
2.3 磷酸鹽及其含量的選擇
磷在微生物生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中起著重要作用,它既是合成核酸、磷脂等含磷化合物的重要元素,又是代謝過(guò)程中許多酶或輔酶的重要組成元素。
以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),考察磷酸鹽對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?，結(jié)果見(jiàn)圖5。
圖5 磷酸鹽對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?/p>
從圖5可看出，在含磷酸二氫鈉的培養(yǎng)基中，米曲霉產(chǎn)氨基?；傅拿富钶^高。因此，選擇磷酸二氫鈉作為磷酸鹽。
磷酸二氫鈉含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶的影響見(jiàn)圖6。
圖6 磷酸二氫鈉含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶的影響
從圖6可看出，當(dāng)磷酸二氫鈉含量為0.2%～0.4%時(shí)，酶活較高；當(dāng)其含量大于0.6%后，對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；覆粌H沒(méi)有促進(jìn)作用，反而有所抑制。這可能是由于隨著磷酸二氫鈉含量的增加，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值下降較大，因而抑制了菌體產(chǎn)酶。
2.4 表面活性劑及其含量的選擇
Tween-80等表面活性劑通常可以增強(qiáng)菌體細(xì)胞膜的通透性,利于菌體攝取營(yíng)養(yǎng)成分,并能促進(jìn)酶等代謝物分泌到胞外。郭海風(fēng)[8]報(bào)道，表面活性劑對(duì)米曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶并無(wú)促進(jìn)作用。固定培養(yǎng)基其它條件不變，考察表面活性劑對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊懀Y(jié)果見(jiàn)圖7。
圖7 表面活性劑對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?/p>
從圖7可看出，與不加任何表面活性劑相比，在培養(yǎng)基中加入表面活性劑Tween-80對(duì)酶活的增加稍有促進(jìn)，其中加入0.1% Tween-80效果更好；而加入Span-80則稍有抑制。因此，選擇在培養(yǎng)基中加入0.1%的Tween-80。
2.5 鎂離子及其含量的選擇
添加鎂離子有利于米曲霉產(chǎn)酶[9]。固定培養(yǎng)基其它條件不變，考察鎂離子含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?，結(jié)果見(jiàn)圖8。
圖8 Mg2+含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?/p>
從圖8可看出，隨著Mg2+含量的增加，酶活逐漸升高；在Mg2+含量為0.2%～0.3%時(shí)，酶活達(dá)到最高；而后酶活隨著Mg2+含量的增加反而降低；當(dāng)Mg2+含量達(dá)到0.6%后，酶活的變化不大。因此，在培養(yǎng)基中加入適量Mg2+可以促進(jìn)產(chǎn)酶。
2.6 正交實(shí)驗(yàn)
根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，培養(yǎng)基的碳源、氮源、磷酸鹽及鎂離子對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；妇休^大影響，進(jìn)一步采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳的培養(yǎng)基組成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表1。
從表1可知，各因素對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶影響大小依次為：硫酸鎂>尿素>麩皮>磷酸二氫鈉，其培養(yǎng)基中最適含量為：麩皮2%、尿素1.5%、磷酸二氫鈉0.3%、硫酸鎂0.35%，添加Tween-80 0.1%。以此培養(yǎng)基發(fā)酵3批樣品，平均酶活為440.51 μmol·g-1·h-1。
3 結(jié)論
通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定最佳碳源為麩皮，最佳氮源為尿素，磷酸鹽、鎂離子、Tween-80對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；妇写龠M(jìn)作用。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)培養(yǎng)基為：麩皮2%、尿素1.5%、磷酸二氫鈉0.3%、硫酸鎂0.35%、Tween-80 0.1%，酶活可高達(dá)440.51 μmol·g-1·h-1。與優(yōu)化前相比，單位酶活提高6倍左右。
表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
參考文獻(xiàn)：
[1] Chibata I,Ishikawa T,Yamada S.L-Amio acid production by aminoacylase fromAspergillus[J].Bull Agr Chem Soc Japan,1957,21:300-306.
[2] 王淑豪，宋正孝，馬忠海,等.米曲霉3042的液體培養(yǎng)特性及其產(chǎn)氨基酰化酶的特性研究[J].食品科學(xué)，2000，21(7)：9-11.
[3] Acuna-Arguelles M E,Gutierrez-Rojas M,Viniegra-Gonzalez G, et al.Production and properties of three pectinolytic activities produced byAspergillusnigerin submerged and solid-state fermentation[J].Appl Microbiol Biotechnol, 1995, 43(5): 808-814.
[4] Kitano H,Kataoka K,Furukawa,et al.Specific expression and temperature-dependent expression of the acid protease-encoding gene(pepA) inAspergillusoryzaein solid-state culture(rice-koji)[J]. J Biosci Bioeng, 2002, 93(6): 563-567.
[5] 石開(kāi)風(fēng)，曹飛，周華,等.米曲氨基?；敢簯B(tài)發(fā)酵條件的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(7)：78-81.
[6] 陳曦,趙建國(guó).飼用酶高產(chǎn)菌株的篩選[J].飼料工業(yè)，2006,27(6): 14-15.
[7] 孫春華，燕磊，常維山.不同碳源和氮源對(duì)米曲霉產(chǎn)酶影響的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，20(5)：986-990.
[8] 郭海風(fēng).β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌及其發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].揚(yáng)州職業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，3(4)：7-12.
[9] 董靜,孟憲軍.米曲霉UC6-90產(chǎn)曲酸的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28(6)：52-56.
猜你喜歡
麩皮摻假咋識(shí)別河南畜牧獸醫(yī)(2021年9期)2021-12-10 麩皮價(jià)格為何再次上漲？今日農(nóng)業(yè)(2017年11期)2017-01-31 無(wú)機(jī)氮源對(duì)紅曲霉調(diào)控初探中國(guó)釀造(2016年12期)2016-03-01 內(nèi)源信號(hào)肽DSE4介導(dǎo)頭孢菌素C?；冈诋叧嘟湍钢械姆置诒磉_(dá) 促?；鞍讓?duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響醫(yī)學(xué)研究雜志(2015年9期)2015-07-01 人參二醇磺?；磻?yīng)的研究云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)(2014年2期)2014-11-07 中藥渣生產(chǎn)蛋白飼料的氮源優(yōu)化研究中國(guó)釀造(2014年9期)2014-03-11 五種小麥麩皮烷基酚類化合物體外抗腫瘤作用及初步的機(jī)制研究食品工業(yè)科技(2014年15期)2014-03-11 小麥麩皮中β-葡聚糖的分離純化及組成研究食品工業(yè)科技(2014年15期)2014-03-11 響應(yīng)面分析法和氮源改進(jìn)優(yōu)化L-賴氨酸發(fā)酵工藝食品工業(yè)科技(2014年9期)2014-03-11
氨基酸的制備方法有蛋白質(zhì)水解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法等，其中化學(xué)合成法因成本低、適于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)而獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。但市場(chǎng)大量需要的是單一構(gòu)型的氨基酸，而化學(xué)合成法得到的產(chǎn)物為外消旋混合物，必須通過(guò)手性拆分才能得到單一構(gòu)型的產(chǎn)品。高效、綠色、安全的氨基酰化酶法是拆分氨基酸的最佳方法之一，目前人們主要應(yīng)用該方法拆分化學(xué)合成法生產(chǎn)的氨基酸DL-消旋體。
氨基?；赣址QN-?；被醽啺坊饷富蝓；?，是一類能夠水解N-?；?DL-氨基酸上酰胺鍵的酶。具有光學(xué)異構(gòu)專一性，能夠選擇性地水解N-?；?DL-氨基酸[1]，通過(guò)分離即可得到光學(xué)純L-或D-氨基酸。因此，高活力和高立體選擇性的氨基酰化酶的生產(chǎn)菌株的選育和產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，是高效、低成本制備氨基酸的基礎(chǔ)。
氨基?；傅膩?lái)源很廣，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的氨基?；笍V泛存在于各種動(dòng)植物的器官內(nèi)、微生物胞內(nèi)或發(fā)酵液中。氨基酰化酶的制備方法有動(dòng)植物組織提取法和微生物發(fā)酵法，由微生物發(fā)酵法制備的氨基?；副葎?dòng)植物提取法制備的更穩(wěn)定、更經(jīng)濟(jì)、底物專一性更強(qiáng)。
目前，用于氨基酸拆分的氨基?；复蠖嘤擅浊拱l(fā)酵得到。 雖然氨基?；覆皇敲浊沟闹饕赶担捎谄渖L(zhǎng)速度快、酶活性高、底物專一性強(qiáng)，尤其適于α-氨基和羥基消旋物特別是外消旋氨基酸的大規(guī)模拆分。因此，由米曲霉發(fā)酵制備大量高活性的氨基?；笇?duì)化工產(chǎn)品的后續(xù)加工非常重要。
作者在此對(duì)誘變而得的最優(yōu)米曲霉菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，探求從外界環(huán)境進(jìn)一步提高米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶的能力，以使氨基?；傅漠a(chǎn)量和質(zhì)量達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的需求，為工業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
1 實(shí)驗(yàn)
1.1 材料、試劑與儀器
米曲霉菌株,實(shí)驗(yàn)室誘變所得；麩皮，自購(gòu)。
N-乙酰-DL-蛋氨酸，張家港市華昌藥業(yè)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
SHZ-82型氣浴恒溫振蕩器，721型可見(jiàn)分光光度計(jì)，YXQG02型手提式電熱壓力蒸汽消毒器，SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，各種玻璃器皿。
1.2 培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，切塊煮沸30 min，過(guò)濾得清液，自來(lái)水補(bǔ)足1000 mL，加入葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，pH值自然，1×105Pa滅菌30 min。
初始發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮0.6 g，蛋白胨0.6 g，硫酸鎂0.03 g，磷酸二氫鉀0.06 g，水30 mL，pH值自然，1×105Pa滅菌30 min。
1.3 方法
1.3.1 斜面培養(yǎng)
接種PDA斜面，于30℃培養(yǎng)4 d，產(chǎn)生大量綠色孢子。
1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)
用無(wú)菌水分2次洗下斜面上的孢子，在玻璃珠三角瓶?jī)?nèi)150 r·min-1振蕩15 min，制得孢子懸液。接種3 mL孢子懸液于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、150 r·min-1培養(yǎng)48 h,收獲培養(yǎng)物。發(fā)酵液抽濾,將菌絲體用蒸餾水沖洗3次,抽干,稱重。
1.4 酶活測(cè)定
取1 g菌體放入100 mL三角瓶中，加入pH值7.0的磷酸緩沖溶液10 mL、0.2 mol·L-1的N-乙酰-DL-蛋氨酸溶液10 mL，于37℃、150 r·min-1搖床振蕩1 h，過(guò)濾，濾液在水浴中煮沸10 min，使酶失活。
采用茚三酮顯色法測(cè)定拆分出的L-蛋氨酸的物質(zhì)的量(mmol·L-1)：將上述濾液稀釋一定倍數(shù)，取稀釋后濾液1 mL，加入pH值5.4的2 mol·L-1醋酸緩沖溶液1 mL和茚三酮顯色液1 mL，混勻后于沸水浴中加熱15 min，自來(lái)水冷卻放置5 min后，加入3 mL60%乙醇稀釋，搖勻后用721型分光光度計(jì)測(cè)定OD570。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)液L-蛋氨酸的物質(zhì)的量。
酶活定義[2]：在37℃、pH值為7.0的條件下，1 g濕菌體1 h拆分所產(chǎn)生的L-蛋氨酸的微摩爾數(shù)。
根據(jù)下式計(jì)算酶活:
式中：C為L(zhǎng)-蛋氨酸的物質(zhì)的量，mmol·L-1；V為酶促反應(yīng)的總體積，L(本實(shí)驗(yàn)為0.02 L)；N為稀釋倍數(shù)；t為搖瓶時(shí)間，h(本實(shí)驗(yàn)為1 h)；M為濕菌絲用量，g(本實(shí)驗(yàn)為1 g)；1000為μmol與mmol的換算基數(shù)。
2 結(jié)果與討論
2.1 碳源及其含量的選擇
固定培養(yǎng)基的其它條件不變，考察碳源對(duì)米曲霉菌株產(chǎn)氨基?；傅挠绊?，結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 碳源對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶的影響
從圖1可看出，碳源對(duì)氨基?；傅拿富钣绊懞艽?。以葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉作為碳源時(shí)，氨基酰化酶的酶活很低；以麩皮為碳源時(shí)，酶活最高；以乳糖或CMC作碳源時(shí),酶活很高,但菌體量很低。這可能是因?yàn)?，麩皮不但可以提供菌體生長(zhǎng)所需的碳水化合物,而且其含有的微量因子可能對(duì)氨基?；傅漠a(chǎn)生有促進(jìn)作用，同時(shí)麩皮能增強(qiáng)培養(yǎng)基的通透性，利于好氧菌的生長(zhǎng)[3～5];而以乳糖和CMC作為碳源時(shí)，由于菌體大量產(chǎn)酶的同時(shí)影響了菌體本身的生長(zhǎng)，所以盡管酶活很高，但菌體量很低，而且用CMC作為碳源的發(fā)酵液極其粘稠，不易分離。因此，選擇麩皮為適宜的碳源。
以麩皮為碳源，考察其含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?，結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 麩皮含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶的影響
從圖2可看出，麩皮含量為1.5%時(shí)，氨基?；傅拿富钭罡?；隨著麩皮含量的增加，菌體量明顯增加，酶活反而下降。這可能是麩皮中某種微量元素的增加造成的，該元素可能特異性促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，而不促進(jìn)或者抑制酶的分泌。
2.2 氮源及其含量的選擇
固定培養(yǎng)基的其它條件不變，考察氮源對(duì)米曲霉菌株產(chǎn)氨基酰化酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 氮源對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?/p>
從圖3可看出，選用無(wú)機(jī)氮源時(shí)氨基?；傅拿富钶^低，而有機(jī)氮源大多能提高氨基?；傅拿富睿渲心蛩貫榈磿r(shí)的酶活最高。因此，選擇尿素為適宜的氮源。
陳曦等[6]報(bào)道,培養(yǎng)基的不同成分可誘發(fā)產(chǎn)生不同的酶；孫春華等[7]報(bào)道，尿素對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶的影響很??；從本實(shí)驗(yàn)可看出，尿素對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶有很大的影響。以尿素為氮源，考察其含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?，結(jié)果見(jiàn)圖4。
圖4 尿素含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?/p>
從圖4可看出，當(dāng)尿素的含量為1.5%時(shí)，米曲霉產(chǎn)氨基?；傅拿富钭罡?。
2.3 磷酸鹽及其含量的選擇
磷在微生物生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中起著重要作用,它既是合成核酸、磷脂等含磷化合物的重要元素,又是代謝過(guò)程中許多酶或輔酶的重要組成元素。
以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),考察磷酸鹽對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?，結(jié)果見(jiàn)圖5。
圖5 磷酸鹽對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?/p>
從圖5可看出，在含磷酸二氫鈉的培養(yǎng)基中，米曲霉產(chǎn)氨基?；傅拿富钶^高。因此，選擇磷酸二氫鈉作為磷酸鹽。
磷酸二氫鈉含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶的影響見(jiàn)圖6。
圖6 磷酸二氫鈉含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶的影響
從圖6可看出，當(dāng)磷酸二氫鈉含量為0.2%～0.4%時(shí)，酶活較高；當(dāng)其含量大于0.6%后，對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；覆粌H沒(méi)有促進(jìn)作用，反而有所抑制。這可能是由于隨著磷酸二氫鈉含量的增加，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值下降較大，因而抑制了菌體產(chǎn)酶。
2.4 表面活性劑及其含量的選擇
Tween-80等表面活性劑通常可以增強(qiáng)菌體細(xì)胞膜的通透性,利于菌體攝取營(yíng)養(yǎng)成分,并能促進(jìn)酶等代謝物分泌到胞外。郭海風(fēng)[8]報(bào)道，表面活性劑對(duì)米曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶并無(wú)促進(jìn)作用。固定培養(yǎng)基其它條件不變，考察表面活性劑對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊懀Y(jié)果見(jiàn)圖7。
圖7 表面活性劑對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?/p>
從圖7可看出，與不加任何表面活性劑相比，在培養(yǎng)基中加入表面活性劑Tween-80對(duì)酶活的增加稍有促進(jìn)，其中加入0.1% Tween-80效果更好；而加入Span-80則稍有抑制。因此，選擇在培養(yǎng)基中加入0.1%的Tween-80。
2.5 鎂離子及其含量的選擇
添加鎂離子有利于米曲霉產(chǎn)酶[9]。固定培養(yǎng)基其它條件不變，考察鎂離子含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?，結(jié)果見(jiàn)圖8。
圖8 Mg2+含量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；傅挠绊?/p>
從圖8可看出，隨著Mg2+含量的增加，酶活逐漸升高；在Mg2+含量為0.2%～0.3%時(shí)，酶活達(dá)到最高；而后酶活隨著Mg2+含量的增加反而降低；當(dāng)Mg2+含量達(dá)到0.6%后，酶活的變化不大。因此，在培養(yǎng)基中加入適量Mg2+可以促進(jìn)產(chǎn)酶。
2.6 正交實(shí)驗(yàn)
根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，培養(yǎng)基的碳源、氮源、磷酸鹽及鎂離子對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；妇休^大影響，進(jìn)一步采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳的培養(yǎng)基組成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表1。
從表1可知，各因素對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基酰化酶影響大小依次為：硫酸鎂>尿素>麩皮>磷酸二氫鈉，其培養(yǎng)基中最適含量為：麩皮2%、尿素1.5%、磷酸二氫鈉0.3%、硫酸鎂0.35%，添加Tween-80 0.1%。以此培養(yǎng)基發(fā)酵3批樣品，平均酶活為440.51 μmol·g-1·h-1。
3 結(jié)論
通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定最佳碳源為麩皮，最佳氮源為尿素，磷酸鹽、鎂離子、Tween-80對(duì)米曲霉產(chǎn)氨基?；妇写龠M(jìn)作用。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)培養(yǎng)基為：麩皮2%、尿素1.5%、磷酸二氫鈉0.3%、硫酸鎂0.35%、Tween-80 0.1%，酶活可高達(dá)440.51 μmol·g-1·h-1。與優(yōu)化前相比，單位酶活提高6倍左右。
表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
參考文獻(xiàn)：
[1] Chibata I,Ishikawa T,Yamada S.L-Amio acid production by aminoacylase fromAspergillus[J].Bull Agr Chem Soc Japan,1957,21:300-306.
[2] 王淑豪，宋正孝，馬忠海,等.米曲霉3042的液體培養(yǎng)特性及其產(chǎn)氨基酰化酶的特性研究[J].食品科學(xué)，2000，21(7)：9-11.
[3] Acuna-Arguelles M E,Gutierrez-Rojas M,Viniegra-Gonzalez G, et al.Production and properties of three pectinolytic activities produced byAspergillusnigerin submerged and solid-state fermentation[J].Appl Microbiol Biotechnol, 1995, 43(5): 808-814.
[4] Kitano H,Kataoka K,Furukawa,et al.Specific expression and temperature-dependent expression of the acid protease-encoding gene(pepA) inAspergillusoryzaein solid-state culture(rice-koji)[J]. J Biosci Bioeng, 2002, 93(6): 563-567.
[5] 石開(kāi)風(fēng)，曹飛，周華,等.米曲氨基?；敢簯B(tài)發(fā)酵條件的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(7)：78-81.
[6] 陳曦,趙建國(guó).飼用酶高產(chǎn)菌株的篩選[J].飼料工業(yè)，2006,27(6): 14-15.
[7] 孫春華，燕磊，常維山.不同碳源和氮源對(duì)米曲霉產(chǎn)酶影響的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，20(5)：986-990.
[8] 郭海風(fēng).β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌及其發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].揚(yáng)州職業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，3(4)：7-12.
[9] 董靜,孟憲軍.米曲霉UC6-90產(chǎn)曲酸的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28(6)：52-56.
猜你喜歡
河南畜牧獸醫(yī)(2021年9期)2021-12-10
今日農(nóng)業(yè)(2017年11期)2017-01-31
中國(guó)釀造(2016年12期)2016-03-01
醫(yī)學(xué)研究雜志(2015年9期)2015-07-01
云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)(2014年2期)2014-11-07
中國(guó)釀造(2014年9期)2014-03-11
食品工業(yè)科技(2014年15期)2014-03-11
食品工業(yè)科技(2014年15期)2014-03-11
食品工業(yè)科技(2014年9期)2014-03-11
