，李元，王常， ，， ,2,3

(1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430068；2.湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068;3.湖北工業(yè)大學(xué)湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068)

油脂按來源可分為動物油脂、植物油脂和微生物油脂。隨著耕地的減少和人口的增加，動植物油脂越來越不能滿足生產(chǎn)和發(fā)展的需求。微生物油脂由于得天獨(dú)厚的優(yōu)勢條件(生產(chǎn)不受場地、季節(jié)等因素的影響)，已引起各國研究者的關(guān)注。微生物油脂主要指由多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)組成的甘油三酯。PUFAs具有很多生理功能，廣泛用于食品、保健、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。其工業(yè)化的最佳途徑是發(fā)酵法[1]。

作者通過蘇丹黑染色初篩及搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，從6種酵母菌中篩選出油脂高產(chǎn)菌株，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種

漢遜氏酵母(Hansenula)、啤酒酵母(S.cerevisiae)、假絲酵母(Candidaoleophila)、產(chǎn)酯酵母(Saccharomyceteesterproduced)、葡萄酒酵母(S.ellipsoideus)、路哥酵母(Saccharomycodesludwigiilog)，自行保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g·L-1):葡萄糖20,酵母膏10,蛋白胨20,瓊脂20,pH值自然。

種子培養(yǎng)基(g·L-1):葡萄糖20,酵母膏5,蛋白胨6，pH值4.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1):葡萄糖40,酵母膏4, MgSO4·7H2O 5, KNO39,(NH4)2SO46, NH4H2PO43, pH值5.5。

1.3 接種和發(fā)酵

從斜面取一環(huán)接種于50 mL(250 mL的三角瓶)種子液中，于28℃、120 r·min-1搖床培養(yǎng)1 d。然后取5 mL種子液接種于45 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、120 r·min-1搖床培養(yǎng)4 d。

1.4 菌種篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.1 菌種初篩

采用蘇丹黑染色法[2]進(jìn)行初篩。用0.5%的蘇丹黑對漢遜氏酵母、啤酒酵母、假絲酵母、產(chǎn)酯酵母、葡萄酒酵母、路哥酵母染色，用二甲苯洗去多余染色液，番紅復(fù)染后鏡檢。顯微鏡下菌絲體呈粉紅色，油脂顆粒呈藍(lán)黑色。通過觀察不同酵母菌中油脂顆粒的大小及多少，選出油脂產(chǎn)量較多的兩種菌進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩。

1.4.2 發(fā)酵復(fù)篩

取初篩得到的菌株發(fā)酵，測出各自的細(xì)胞量和油脂含量[1]，算出油脂產(chǎn)量，確定油脂產(chǎn)量最高的菌種進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。

1.4.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

以細(xì)胞量和油脂含量[3]為指標(biāo)，對初始pH值、溫度等培養(yǎng)條件和碳、氮源進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 分析方法

1.5.1 生長曲線的繪制

取活化后斜面菌種一環(huán)，接種于50 mL液體種子培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h，取5 mL液體轉(zhuǎn)移到45 mL液體種子培養(yǎng)基中，每隔一定時間取樣，在600 nm處測定光密度值，以發(fā)酵周期為橫坐標(biāo)、OD600值為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長曲線。

1.5.2 細(xì)胞量的測定

取一定體積(V)的發(fā)酵液于恒重的離心管(m1)中，在3000 r·min-1下離心10 min，棄上清，沉淀用蒸餾水清洗2次，在3000 r·min-1下離心10 min，棄上清，于80℃烘干至恒重后取出，干燥器中自然冷卻至室溫后稱量(m2)。細(xì)胞量(g·L-1)依下式計(jì)算：

1.5.3 菌體油脂含量的測定

(1)采用索氏提取法[1]。將一定量的干細(xì)胞用濾紙包裹放入提取管中，以石油醚為溶劑回流，細(xì)胞內(nèi)油脂隨石油醚進(jìn)入平底燒瓶中，回流6～8 h后，回收石油醚并蒸干平底燒瓶，于電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干稱量，計(jì)算平底燒瓶提取前后質(zhì)量差值，可準(zhǔn)確測得細(xì)胞油脂含量。

(2)采用蘇丹黑比色法[3]。取一定體積的發(fā)酵液離心洗滌，用0.3%蘇丹黑對細(xì)胞染色，用乙醇洗去多余染色液，并將細(xì)胞溶于同體積去離子水中，以未染色的細(xì)胞為參比，在OD580下測吸光度值，胞內(nèi)油脂含量越高吸光度值越大，據(jù)此可快速直觀地比較同種菌株不同條件下產(chǎn)油脂情況。吸光度值和油脂含量關(guān)系見圖1。

圖1 油脂含量與吸光度值關(guān)系

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種初篩

用蘇丹黑染色法[2]對6種酵母染色、鏡檢，顯微鏡照片見圖2。

圖2 6株蘇丹黑染色酵母的顯微鏡照片

由圖2可見，假絲酵母和啤酒酵母油脂顆粒較大，均呈油滴狀。因此，選取假絲酵母和啤酒酵母進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩。

2.2 發(fā)酵復(fù)篩

2.2.1 假絲酵母和啤酒酵母的生長曲線(圖3)

圖3 假絲酵母和啤酒酵母的生長曲線

由圖3可見，假絲酵母在第6 h進(jìn)入對數(shù)生長期，第20 h進(jìn)入了穩(wěn)定期；啤酒酵母在第6 h進(jìn)入對數(shù)生長期，第12 h進(jìn)入了穩(wěn)定期。達(dá)到穩(wěn)定期后假絲酵母的OD600比啤酒酵母高出很多。這說明同體積的發(fā)酵液假絲酵母能收獲更多的細(xì)胞。

2.2.2 假絲酵母和啤酒酵母的細(xì)胞量和油脂含量

以相同的接種量(10%)對假絲酵母和啤酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)4 d，測細(xì)胞量和油脂含量，計(jì)算油脂產(chǎn)量，結(jié)果見表1。

表1 假絲酵母和啤酒酵母細(xì)胞量和油脂產(chǎn)量

由表1可見，假絲酵母細(xì)胞量、油脂含量、油脂產(chǎn)量分別是啤酒酵母的1.64倍、1.14倍和1.87倍，故確定假絲酵母為油脂高產(chǎn)菌種進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)溫度對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響(圖4)

圖4 培養(yǎng)溫度對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響

由圖4可見，細(xì)胞量在20～28℃范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)溫度的上升而增加，而在28～32℃不再增加；油脂含量隨培養(yǎng)溫度的升高先上升后下降，24℃時油脂含量最高。這說明細(xì)胞生長和油脂合成的最適培養(yǎng)溫度不同，為使最終油脂產(chǎn)量達(dá)到最大，可采用控溫法來調(diào)節(jié)整個發(fā)酵過程，即發(fā)酵前期控制溫度在28℃，待細(xì)胞量維持穩(wěn)定后適當(dāng)降低溫度以促進(jìn)油脂的合成。

2.3.2 初始pH值對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響(圖5)

圖5 初始pH值對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響

由圖5可見，在選取的初始pH值范圍內(nèi)，細(xì)胞量和油脂含量均先上升后下降，并均于初始pH值為6.0時達(dá)到最大，因此選擇假絲酵母生長和油脂合成的初始pH值為6.0。

2.3.3 發(fā)酵周期對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響(圖6)

圖6 發(fā)酵周期對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響

由圖6可見，細(xì)胞量和油脂含量均隨著發(fā)酵周期的延長而增加，但發(fā)酵超過4 d以后，細(xì)胞量和油脂含量的增長非常有限。考慮經(jīng)濟(jì)因素，選擇發(fā)酵周期為4 d。

2.3.4 接種量對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響(圖7)

圖7 接種量對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響

由圖7可見，細(xì)胞量和油脂含量均隨著接種量的增加先上升后下降，并都在接種量為10%時達(dá)到最大。因此，選擇接種量為10%。

2.3.5 轉(zhuǎn)速對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響(圖8)

圖8 轉(zhuǎn)速對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響

由圖8可見，轉(zhuǎn)速從120 r·min-1提高到180 r·min-1，細(xì)胞量和油脂含量相應(yīng)上升；轉(zhuǎn)速超過180 r·min-1后，細(xì)胞量和油脂含量均趨于穩(wěn)定。因此，選擇轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。

2.4 碳、氮源選擇

2.4.1 碳源對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響

分別選擇葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖為碳源，添加量均為4%，其它成分不變，搖瓶發(fā)酵4 d，測細(xì)胞量和油脂含量，結(jié)果見圖9。

圖9 碳源對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響

由圖9可見，以葡萄糖為碳源時，細(xì)胞量和油脂含量都達(dá)到最大，即葡萄糖最有利于細(xì)胞生長和油脂合成，是最佳碳源。

2.4.2 氮源對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響

氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)(氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等)和含氮代謝物[4]。分別選取蛋白胨、酵母膏、硝酸鉀、磷酸二氫銨、硫酸銨為氮源，添加量均為0.4%，其它成分不變，搖瓶發(fā)酵4 d，測細(xì)胞量和油脂含量，結(jié)果見圖10。

圖10 氮源對假絲酵母細(xì)胞量和油脂含量的影響

由圖10可知，酵母膏是菌體生長最佳氮源，硫酸銨有利于油脂合成，因此，選定酵母膏為氮源，并添加適量硫酸銨促進(jìn)油脂合成。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用優(yōu)化前、后的碳、氮源和培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 優(yōu)化前后發(fā)酵結(jié)果

由表2可見，發(fā)酵條件優(yōu)化后，假絲酵母的細(xì)胞量、油脂含量、油脂產(chǎn)量分別是優(yōu)化前的142%、171%、245%。

3 結(jié)論

對6種酵母菌進(jìn)行初篩和復(fù)篩，選出假絲酵母為油脂高產(chǎn)菌株，確定其最適培養(yǎng)條件為：初始pH值6.0,轉(zhuǎn)速180 r·min-1,接種量10%，發(fā)酵周期4 d，培養(yǎng)溫度采用兩階段法即發(fā)酵前期溫度控制在28℃，待細(xì)胞量維持穩(wěn)定后適當(dāng)降低溫度以促進(jìn)油脂的合成；最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母膏，并添加適量硫酸銨促進(jìn)油脂合成。優(yōu)化后假絲酵母的細(xì)胞量、油脂含量、油脂產(chǎn)量分別是優(yōu)化前的142%、171%、245%。

參考文獻(xiàn)：

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