5′-三磷酸腺苷 (Adenosine triphosphate,ATP)又名腺三磷、腺嘌呤配糖三磷酸，臨床應(yīng)用廣泛，是用于治療進(jìn)行性肌萎縮、腦溢血后遺癥、心機(jī)能不全、心肌疾患及肝炎等疾病的輔酶類藥物，被稱為人體內(nèi)的“能量貨幣”[1]。

在ATP的制備、存儲(chǔ)過程中，易混入或產(chǎn)生一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)等雜質(zhì)。ATP、ADP及AMP的結(jié)構(gòu)相似、理化性質(zhì)相近，因此檢測(cè)較為困難[2]。我國(guó)部標(biāo)和地方標(biāo)準(zhǔn)均采用紙電泳法[3]或紙層析法[4]測(cè)定ATP含量，存在操作時(shí)間長(zhǎng)、誤差較大、操作繁瑣的缺點(diǎn)。也有報(bào)道采用生物發(fā)光法測(cè)定ATP含量，但該方法不能對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行分析[5]。作者采用高效液相色譜法測(cè)定ATP含量，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

對(duì)照品：ATP二鈉(Sigma)，ADP (中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司)，AMP(中科院上海生化所東風(fēng)生化技術(shù)公司)；樣品：ATP二鈉(批號(hào)：200209070,上海太平洋制藥廠)；NH3·H2O、磷酸二氫銨，分析純。

Waters 600型高效液相色譜工作系統(tǒng),PDA996型二極管陣列檢測(cè)器；WFZ800-D2C型紫外可見分光光度計(jì),北京瑞利分析儀器公司；PHS-3C型精密pH計(jì),上海雷磁。

1.2 色譜條件

色譜條件為：XTerraTMRP18(3.9 mm×150 mm，5 μm) 色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)259 nm，柱溫(25±2)℃,流動(dòng)相為0.05 mol·L-1pH值7.0的NH4H2PO4緩沖溶液，進(jìn)樣量20 μL，流速1.0 mL·min-1。

1.3 ATP含量的計(jì)算

按1.2條件測(cè)定ATP、ADP和AMP的HPLC譜圖，樣品中ATP的含量依下式計(jì)算：

式中：ξ為樣品中ATP質(zhì)量分?jǐn)?shù)；VS為樣品液體積；AL為對(duì)照品ATP峰面積；cL為對(duì)照品溶液中ATP濃度；WS為配制樣品液中ATP質(zhì)量；AS為樣品ATP峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 波長(zhǎng)的選擇

配制0.05 mol·L-1pH值7.0的NH4H2PO4緩沖溶液，用該緩沖溶液配制0.009250 g·L-1ATP對(duì)照品溶液。以NH4H2PO4緩沖溶液為參比，對(duì)ATP溶液進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，ATP在208 nm和259 nm處有大的吸收值。由于259 nm處波峰較寬、數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定，因此選用259 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 ATP紫外掃描圖譜

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由于ATP、ADP、AMP在波長(zhǎng)259 nm處都具有最大吸收且摩爾吸光系數(shù)相同，因此可用紫外分光光度法對(duì)其線性關(guān)系進(jìn)行考察[6]。

準(zhǔn)確稱取ATP對(duì)照品0.008278 g，置于100 mL容量瓶中，用0.05 mol·L-1pH值7.0的NH4H2PO4緩沖溶液定容至刻度，搖勻作為ATP對(duì)照品溶液。精密量取ATP對(duì)照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL,分別置5 mL容量瓶中,用NH4H2PO4緩沖溶液定容至刻度，搖勻。

以NH4H2PO4緩沖溶液為參比，測(cè)定各溶液259 nm處吸光度值A(chǔ)259。以A259為縱坐標(biāo)、ATP濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。

圖2 ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可知，ATP濃度在10～80 mg·L-1范圍內(nèi)與259 nm處吸光度值呈良好線性關(guān)系，擬合線性回歸方程為：y=0.03508+24.2365x(R=0.9994)。

2.3 HPLC檢測(cè)結(jié)果

在1.2條件下ATP對(duì)照品、ADP對(duì)照品、AMP對(duì)照品和ATP樣品的HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。溶液濃度均為20 mg·L-1。

圖3 ATP、ADP和AMP的HPLC圖譜

由圖3可知，ATP、ADP、AMP的出峰順序?yàn)锳TP>ADP>AMP。主峰ATP峰的保留時(shí)間為1.4～1.5 min，較靠后的AMP峰的保留時(shí)間為3.2～3.3 min。此外，在ATP樣品的HPLC譜圖中還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Ado(腺苷)峰，其保留時(shí)間為5.6 min，該峰的出現(xiàn)可能與生產(chǎn)樣品ATP的底物有關(guān)。整個(gè)色譜檢測(cè)過程可在7 min內(nèi)完成。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別取ATP對(duì)照品、ADP對(duì)照品和AMP對(duì)照品的溶液各20 mg·L-1，重復(fù)進(jìn)樣3次，計(jì)算峰面積，RSD分別為0.81%、1.96%、1.28%。

2.5 方法的回收率

以20 mg·L-1的ATP對(duì)照品溶液作為外標(biāo)溶液，精確量取兩管(各5 mL)外標(biāo)溶液，分別加入NH4H2PO4緩沖溶液和ATP樣品溶液各5 mL，另取一管分別加入NH4H2PO4緩沖溶液和ATP樣品溶液各5 mL，進(jìn)行色譜分析，每管進(jìn)樣2次，計(jì)算得平均回收率為98.87%，RSD為1.02%。

2.6 樣品測(cè)定

按1.2色譜條件，精確量取樣品溶液和對(duì)照品溶液各20 μL，重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)得ATP含量為95.6%，RSD為0.85%。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法測(cè)定5′-三磷酸腺苷含量。色譜條件為：XTerraTMRP18(3.9 mm×150 mm，5 μm) 色譜柱，流動(dòng)相為0.05 mol·L-1pH值7.0 的NH4H2PO4緩沖溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)259 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫(25±2)℃,進(jìn)樣量20 μL。在10～80 mg·L-1范圍內(nèi)，ATP濃度與259 nm處吸光度值呈良好線性關(guān)系，R=0.9994；檢測(cè)重復(fù)性較好，平均回收率為98.87%，整個(gè)色譜過程可在7 min內(nèi)完成。該方法也可用于ADP和AMP的分離檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 程敘揚(yáng)，李曉玫.細(xì)胞外三磷酸腺苷的代謝及其生物學(xué)作用[J].中國(guó)病理生理雜志，1998，14(4)：438-441.

[2] 陳燕敏，姜開余，陳幼亭．三磷酸腺苷溶液的穩(wěn)定性考察[J]．蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，17(1)：128，130．

[3] WS1-C3-0001-89,三磷酸腺苷二鈉[S].

[4] GB 15356-94,生化試劑核苷酸測(cè)定[S]．

[5] Andreotti Peter E (Boca Raton.FL)．Device for measuring ATP[P]．USP 5 916 802,1999-06-29.

[6] 王龍耀，范利華，肖安風(fēng),等．ATP的分析方法綜述[J]．天津化工，2003，17(2)：30-33．