張順明 袁小敏

江蘇省南京市六合區(qū)人民醫(yī)院（211500）

T細(xì)胞活化及效應(yīng)除了需T細(xì)胞受體識(shí)別MHC-抗原肽復(fù)合物外，還需要抗原呈遞細(xì)胞上的共刺激信號(hào)的參與[1]。共刺激分子在T細(xì)胞應(yīng)答的不同時(shí)空階段，對T細(xì)胞的活化、凋亡、分化和效應(yīng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。B7 家族是最重要的共刺激分子之一，主要包括 B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、B7-H1和B7-H2等。腫瘤壞死因子是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用和協(xié)同效應(yīng)。本研究觀察了腫瘤壞死因子（TNF）誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞的凋亡作用，并觀察TNF對B7-H1的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌HepG2細(xì)胞株購于上海細(xì)胞研究所；TNF-α，10萬U/瓶，購于南京醫(yī)藥公司；二甲基亞砜（ DMSO），HEPES均購于Sigma公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購于Gibco公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購于南京凱基生物公司；RT-PCR試劑盒購于大連寶生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5 %的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞為貼壁生長，0.25%的胰蛋白酶消化傳代，每隔2d換液。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

收集對照、各濃度（0、100、200、400、800U/mL）TNF-α干預(yù)48h后的Hep G2細(xì)胞1.0×106/mL，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔取1mL細(xì)胞，1000r/min，4℃離心10min，棄上清。加入1mL冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮。1000r/min，4℃離心10min，棄上清。重復(fù)用冷的PBS洗2次。將細(xì)胞重懸于200μL結(jié)合緩沖液。加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15min。加入300μL結(jié)合緩沖液，1h內(nèi)上機(jī)檢測細(xì)胞的凋亡率。

1.4 RT-PCR檢測HepG2細(xì)胞B7-H1基因表達(dá)

取對數(shù)生長期細(xì)胞約1×106/mL，分別予0、100、200、400、800U/mL干預(yù)，37℃培養(yǎng)48h后，加入1mL Trizol試劑，按試劑盒說明書步驟抽提總RNA。每組取1μL總RNA模板建立20μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，42℃反應(yīng)60min，99℃滅活5min。每組各取1μL cDNA模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，β-actin作為內(nèi)參照同步擴(kuò)增。B7-H1基因引物序列為上游5′-TCGCCGTCTCCTACCA-3′，下游5′-GGCAATGATCCCAAAGTA-3′，擴(kuò)增片斷為221bp；PCR反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件均為 94℃預(yù)變性 3min，94 ℃變性 30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7min，PCR 產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 凋亡結(jié)果

流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率見圖1，結(jié)果顯示各濃度組TNF-α干預(yù)后，Hep G2細(xì)胞凋亡率與對照組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異（P＜0.05），但是各濃度組之間無明顯差別（P＞0.05），提示TNF-α可以誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞凋亡，但細(xì)胞凋亡程度不隨TNF-α濃度升高而增加，見表1。

表1 TNF-α作用48h后Hep G2細(xì)胞的凋亡率（%）

2.2 RT-PCR結(jié)果

用Smartview電泳圖像分析軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，讀取HepG2細(xì)胞B7-H1和β-actin的斑點(diǎn)密度掃描值，以β-actin為內(nèi)對照，分別計(jì)算不同藥物濃度處理后的HepG2細(xì)胞的B7-H1與β-actin 比值（圖2）。分析結(jié)果如表2所示，B7-H1基因在HepG2細(xì)胞系呈微弱表達(dá)，100、200、400、800U/mL的TNF-α作用48h后，B7-H1基因表達(dá)分別有所上調(diào)，與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但各濃度組之間無明顯差異（P＞0.05）。

表2 不同濃度TNF-α干預(yù)HepG2細(xì)胞48h后B7-H1基因表達(dá)的灰度比值

圖1 不同TNF-α濃度干預(yù)的FCM結(jié)果

圖2 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3 討 論

目前研究證明免疫功能失調(diào)、尤其是T 細(xì)胞免疫功能失常，使腫瘤細(xì)胞在發(fā)生早期能夠逃逸免疫監(jiān)控和免疫攻擊，從而發(fā)展至臨床階段[2]。機(jī)體抗腫瘤細(xì)胞免疫主要由T 細(xì)胞介導(dǎo)，而T細(xì)胞的激活需要3種信號(hào)：①特異性刺激信號(hào)Ag-MHC復(fù)合物；②有共刺激分子提供的共刺激信號(hào)；③細(xì)胞因子對T細(xì)胞的激活[3]。B7-H1是B7分子家族的第3個(gè)成員，不同于B7-1、B7-2，它不與CD28、CTLA-4結(jié)合，與其配體作用共同刺激T細(xì)胞對多克隆刺激素的反應(yīng)，在細(xì)胞免疫反應(yīng)中可能起負(fù)性調(diào)節(jié)作用[4]。

國內(nèi)外研究表明，TNF對許多腫瘤細(xì)胞如前列腺癌細(xì)胞系PC3及某些白血病細(xì)胞系等具有明顯的抑制生長作用，而對正常細(xì)胞無細(xì)胞毒性作用[5]。TNF通過以下環(huán)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用：①通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞 TNF受體表達(dá)而增強(qiáng)抗腫瘤作用；②減少蛋白質(zhì)合成，使細(xì)胞損傷修復(fù)減少，細(xì)胞毒性作用增強(qiáng)；③TNF作用在G2或M期[6]。鑒于TNF在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均有一定抗腫瘤作用，人們在臨床中試驗(yàn)性應(yīng)用TNF治療腫瘤，但效果并不使人滿意，因而有待于進(jìn)一步地研究其作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，TNF-α可以通過一定的機(jī)制上調(diào)HepG2細(xì)胞表面B7-H1分子的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮一定的抗腫瘤效應(yīng)，為以后的進(jìn)一步研究提供了一定的理論依據(jù)。

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