鐘加滕,劉 菲,衣豪偉,孫 琳,于慧美,楊冬艷

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,吉林長春130021;2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)七年制;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長春130033)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是成年人最常見的腎臟惡性腫瘤,而且其發(fā)病率仍在逐年增加[1]。腎細(xì)胞癌的自然過程極難預(yù)料,總的5年生存率很低。Notch信號途徑是通過局部細(xì)胞間相互作用控制細(xì)胞命運的一種途徑,它在進(jìn)化中非常保守,在發(fā)育過程的調(diào)控中發(fā)揮重要作用.本實驗對手術(shù)獲得的腎細(xì)胞癌標(biāo)本Notch信號通路相關(guān)受體、配體mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行研究,明確Notch與腎細(xì)胞癌的關(guān)系,為其作為腎癌篩選標(biāo)志物提供理論依據(jù),揭示腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的可能分子機制,從而提高治療的合理性和有效性。

1 材料與方法

1.1主要試劑Trizol試劑、RT-PCR試劑盒購自Invitrogen公司;高保真TaqDNA聚合酶、MMV逆轉(zhuǎn)錄酶、DNAMarker、DNA凝膠回收試劑盒均購自大連寶生物工程公司;瓊脂糖購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。溴化乙錠DEPC購自德國Merk公司;dNTP購自Promega公司;其它常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2標(biāo)本獲取與保存超聲引導(dǎo)下穿刺活檢及手術(shù)獲得2007年9月至2009年5月到中日聯(lián)誼就診并被診斷為腎細(xì)胞癌的患者的腎細(xì)胞癌標(biāo)本,將收集好的標(biāo)本立即放入液氮中保存。

1.3RT-PCR 檢測Notch信號通路受體Notch-2、Notch-3和Notch信號通路配體 Jagged-1、Delta-1mRNA水平液氮研磨組織塊,用TRIzol試劑提取組織中的總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄酶和Oligo d(T)18、dNTP將總 RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA,之后取 1 μ l進(jìn)行 PCR(Takara)反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照,引物序列及PCR產(chǎn)物片斷大小見表1,PCR反應(yīng)條件:Notch-2、Jagged-1和 Delta-1為30循環(huán) ,變性 94℃、30 s,退火55℃、30 s,延伸 72℃、30 s;Notch-3 為 30循環(huán),變性94℃、30 s,退火 56℃、30 s,延伸 72℃、30 s;GAPDH為28 循環(huán),變性 94℃、30 s,退火 58℃、30 s,延伸72℃、30 s。擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分析(上海天能科技有限公司GIS凝膠成像系統(tǒng)),以目的基因電泳條帶密度值灰度×面積與內(nèi)參GAPDH比值確定其含量。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果以s表示,采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對8例癌癥組織和癌旁組織標(biāo)本中Notch信號通路分子的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,各項檢測指標(biāo)比較采用t檢驗。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1Notch信號通路受體Notch-2 mRNA水平的RTPCR的結(jié)果顯示與癌旁組織相比,癌癥組織中Notch-2 mRNA水平明顯升高(P＜0.01),結(jié)果見表2,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,其中三例標(biāo)本的RT-PCR電泳結(jié)果見圖1。

2.2Notch信號通路受體Notch-3 mRNA水平的RTPCR的結(jié)果顯示與癌旁組織相比,癌癥組織中Notch-3 mRNA水平明顯升高(P＜0.01),結(jié)果見表2,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,其中三例標(biāo)本的RT-PCR電泳結(jié)果見圖1。

2.3Notch信號通路配體Jagged-1 mRNA水平的RT-PCR的結(jié)果顯示與癌旁組織相比,癌癥組織中Jagged-1 mRNA水平明顯升高(P＜0.01),結(jié)果見表2,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,其中三例標(biāo)本的RT-PCR電泳結(jié)果見圖1。

2.4Notch信號通路配體Delta-1 mRNA水平的RTPCR的結(jié)果顯示與癌旁組織相比,癌癥組織中Delta-1 mRNA水平明顯升高(P＜0.01),結(jié)果見表2,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,其中三例標(biāo)本的RT-PCR電泳結(jié)果見圖1。

Fig.1 The Notch-2、Notch-3、Jagged-1and Detla-1 mRNA expression in kidney carcinoma tissue

2.58例電泳結(jié)果的灰度值比較見表2

3 討論

Notch信號途徑是通過局部細(xì)胞間相互作用控制細(xì)胞命運的一種途徑,它在進(jìn)化中非常保守,在發(fā)育過程的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。哺乳動物有4種Notch受體(Notch1-4)和5種配體(Jagged1,2和Delta 1,3和4)。在正常情況下Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)能調(diào)節(jié)細(xì)胞對分化信號的識別能力,在調(diào)控細(xì)胞生長分化、組織更新及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。人類許多實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤均發(fā)現(xiàn)Notch1受體的異常表達(dá)[2-6],越來越多證據(jù)表明Notch1與腫瘤發(fā)生有關(guān)。但在不同腫瘤細(xì)胞中的具體表現(xiàn)又有明顯的不同,Notch信號途徑在腫瘤細(xì)胞中具有雙重特性。多數(shù)研究結(jié)果顯示Notch具有促癌作用,但也有文獻(xiàn)報道為抑癌作用。Tonon等[7]闡述了Notch作為癌基因在信號通路中的作用,而Nicolas等[8]則提出在鼠皮膚癌發(fā)生中,Notch1為抑癌作用而不是促癌作用。此外,還有研究證明人的乳腺癌中,Notch1常與腫瘤的發(fā)生有關(guān),而Notch2與腫瘤的抑制有關(guān)[9]。與之相反,人的腦腫瘤中,Notch1與腫瘤的抑制有關(guān)而Notch2與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[10]。這是由于大多數(shù)腫瘤表達(dá)不只一種Notch配體和/或受體,因此這些配體/受體總的表達(dá)最終決定Notch信號是促進(jìn)腫瘤的發(fā)生還是抑制腫瘤的發(fā)生。

表2 8例腎細(xì)胞癌標(biāo)本Notch信號途徑分子表達(dá)水平

目前對于腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)的發(fā)生發(fā)展與Notch信號通路的關(guān)系的研究在逐漸增多,最新的研究表明[11],Notch信號通路在RCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用,本實驗的研究結(jié)果顯示,Notch信號通路的受體Notch-2、Notch-3以及Notch信號通路的配體Jagged-1在癌癥組織中的表達(dá)有了明顯的升高,提示Notch信號通路與RCC的發(fā)生呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性,為其作為腎癌篩選標(biāo)志物提供一定的理論依據(jù)。但是明確Notch信號通路與RCC發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系還需要做進(jìn)一步研究。

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