于慶功,常慧麗,李明強(qiáng),舒 敏,王 偉,劉春英

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科,遼寧大連116001)

Syk(Spleen tyrosine kinase)是一種B細(xì)胞激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中最重要的激酶[1]。近來對(duì)Syk與腫瘤相關(guān)性研究證實(shí),Syk可以抑制多種惡性腫瘤的生長(zhǎng),從而引發(fā)了對(duì)非受體酪氨酸激酶在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中作用的研究。腫瘤的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移是多階段、多因素的復(fù)雜過程,其中逃避免疫監(jiān)視則是最為重要的環(huán)節(jié)之一[2]。因此,分析與Syk基因有關(guān)的抗腫瘤免疫活性,探討因Syk表達(dá)缺失而導(dǎo)致的腫瘤免疫逃逸作用及其機(jī)制具有十分重要的價(jià)值。本研究將Syk基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中,在脂質(zhì)體作用下將該載體轉(zhuǎn)染人結(jié)腸腺癌細(xì)胞LoVo,檢測(cè)該細(xì)胞的生長(zhǎng)周期變化。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系LoVo購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DH5α,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLNCX為本室保存。PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA連接試劑盒和限制性內(nèi)切酶購自寶生物大連有限公司 。TRIzolTM Reagent、Lipofectamin、Genecitin 購自GIBCO BRL公司。

1.2 方法

1.2.1目的基因的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)按TR I-zol試劑盒說明書提取脾臟組織總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒操作說明擴(kuò)增Syk cDNA。根據(jù)Gen-Bank中登錄的Syk cDNA序列設(shè)計(jì)引物,上游引物序列為:5′2CACC ATG GCC AGC AGC GGC ATGGCT G23′,下游引物序列為 :5′2GTT CAC CAC GTC ATA GTAGTA ATT GCG23′。hGAPDH PCR 引物:5′-TCC TCT GAC TTC AAC AGC GAC ACC-3′和 5′-TCT CTC TTC CTC TTG TGC TCT TGG-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物用 5 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.2Syk基因逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 收集脾臟組織細(xì)胞,一步法提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其擴(kuò)增長(zhǎng)度為1909bp。循環(huán)參數(shù)為:預(yù)變性94℃1分鐘,變性98℃10秒;退火55℃30秒;延伸72℃1分鐘,循環(huán)30次,后延伸72℃5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,回收。回收的PCR產(chǎn)物和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體分別用Cla I和Hind III雙酶切,在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行目的基因cDNA片段克隆,構(gòu)建成Syk基因的真核表達(dá)載體,命名為pLNCX-Syk。質(zhì)粒pLNCXSyk轉(zhuǎn)化到DH5?感受態(tài)菌,通過PCR、酶切鑒定重組,采用ABI PRISMTM 377(Perkin Elmer)型全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3pLNCX-Syk轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞 pLNCX-Syk質(zhì)粒經(jīng)Lipofectamine介導(dǎo)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后36小時(shí),加入 Genecitin(200 μ g/ml)篩選細(xì)胞。篩選7天,挑出耐受新霉素而能生長(zhǎng)的陽性克隆命名為pLNCX-Syk+,此時(shí)空白對(duì)照細(xì)胞全部死亡。Genecitin終濃度改用100 μ g/ml擴(kuò)增培養(yǎng)陽性克隆5周后,用于以下實(shí)驗(yàn)?？召|(zhì)粒載體pLNCX轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞的陽性克隆命名為pLNCX-Syk-,作為陰性對(duì)照。

1.2.4Southern blot分析 為了檢測(cè)外源基因是否整合于結(jié)腸癌細(xì)胞基因組之中,選擇逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上的抗性基因——新霉素(Neo)基因編碼區(qū)片段作為探針進(jìn)行雜交,探針大小為770 bp。選擇Neo基因編碼區(qū)兩側(cè)的EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn),對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切。提取細(xì)胞基因組DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上,以Neo為探針進(jìn)行雜交。

1.2.5轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Syk基因轉(zhuǎn)錄的檢測(cè) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引物經(jīng)計(jì)算機(jī)網(wǎng)上檢索確認(rèn)與人類細(xì)胞基因組無同源性,所以細(xì)胞基因組中如果沒有外源載體引物基因,RT-PCR結(jié)果將為陰性。如有載體引物基因mRNA轉(zhuǎn)錄,RT-PCR將為陽性結(jié)果。使用載體引物,RT-PCR鑒定Syk基因mRNA在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中以DEPC水代替AMV作為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,回收片段并純化,以載體引物為測(cè)序引物,對(duì)上述片段進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6細(xì)胞生長(zhǎng)倍增時(shí)間的測(cè)定 接種細(xì)胞(1×104/孔)于24孔板中,每隔24h對(duì)每種細(xì)胞的3個(gè)孔進(jìn)行消化計(jì)數(shù),求平均值。細(xì)胞倍增時(shí)間計(jì)算方法:培養(yǎng)96小時(shí)后計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)=接種的細(xì)胞數(shù)×2n(n=細(xì)胞96小時(shí)的增殖倍數(shù)),細(xì)胞倍增時(shí)間(小時(shí))=96/n

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pLNCX-Syk的鑒定

重組質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶Cla I和HindⅢ雙酶切,1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示的條帶與設(shè)計(jì)大小一致[圖1]。應(yīng)用pLNCX載體引物進(jìn)行目的基因測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與Gene Bank(AF015950)完全一致,沒有發(fā)生堿基突變。

2.2 Southern雜交鑒定

用EcoRⅠ和BamH Ⅰ雙酶切,可切下包含Neo基因編碼區(qū)的DNA片段。因此,以Neo基因編碼區(qū)片段作為探針進(jìn)行雜交,可以檢測(cè)到分子量在1 900 bp左右的雜交帶[圖2]。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX和pLNCX-Syk質(zhì)粒的LoVo細(xì)胞均有雜交帶,而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有雜交帶。說明外源Syk基因已整合到LoVo細(xì)胞基因組。

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Syk基因mRNA水平的檢測(cè)

提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總 RNA,應(yīng)用載體引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),結(jié)果表明Syk基因在mRNA水平有轉(zhuǎn)錄,而陰性對(duì)照則沒有轉(zhuǎn)錄[圖3]。同時(shí)將RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,回收片段并純化,以pLNCX載體引物為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全一致,再次證明外源Syk基因在細(xì)胞內(nèi)能夠轉(zhuǎn)錄。

2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)分析

pLNCX-Syk+細(xì)胞較pLNCX-Syk-細(xì)胞生長(zhǎng)明顯緩慢,pLNCX-Syk-細(xì)胞的倍增時(shí)間為30-33小時(shí),而pLNCX-Syk+細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)至68-72 h,說明對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定

圖2 Southern雜交鑒定

圖3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Syk基因mRNA水平的檢測(cè)

3 討論

人類Syk編碼基因?yàn)镾yk基因,位于人類染色體9q22,蛋白質(zhì)分子量為72 KD,由629個(gè)氨基酸組成,是一種非受體型的酪氨酸激酶,在B細(xì)胞的成熟和活化過程中起關(guān)鍵性作用[3]。Syk在自體磷酸化部位含有兩個(gè)Src同源功能區(qū)SH2(N)和SH2(C),與T細(xì)胞激活中的ZAP-70屬于同一個(gè)蛋白酪氨酸激酶(PTKs)家族,是磷酸化ITAM(依賴?yán)野彼岬拿庖呤荏w活化基序)招募的首選對(duì)象,與之結(jié)合后而激活,進(jìn)而啟動(dòng)B細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,激活各種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,使相應(yīng)基因產(chǎn)物表達(dá),調(diào)整B細(xì)胞等細(xì)胞克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞分化或凋亡[4]。Syk基因的表達(dá)缺失會(huì)致T、B淋巴細(xì)胞活化障礙,失去了對(duì)異化細(xì)胞的監(jiān)測(cè)作用,從而導(dǎo)致腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移[5,6]。研究發(fā)現(xiàn),Syk不但是免疫調(diào)節(jié)因子,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤的發(fā)病過程中存在著Syk表達(dá)缺失的現(xiàn)象。Coopman等發(fā)現(xiàn)Syk是促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的強(qiáng)力因子,他們通過正常乳腺組織和乳腺癌的原位雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Syk在正常乳腺上皮細(xì)胞和正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF10A中表達(dá),在原位癌中表達(dá)受抑制,而在有典型惡性表現(xiàn)(高轉(zhuǎn)移性和侵襲性)的乳腺癌中表達(dá)缺失,進(jìn)而提出Syk表達(dá)缺失與腫瘤的發(fā)生存在相關(guān)性[7]。Sada等認(rèn)為Syk是一種候選抑癌基因,Syk的表達(dá)缺失會(huì)致免疫細(xì)胞發(fā)育、成熟障礙,重者會(huì)導(dǎo)致重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID),由于機(jī)體免疫細(xì)胞的成熟障礙,機(jī)體的免疫監(jiān)測(cè)力下降,對(duì)突變、異常增生的細(xì)胞失去免疫力,從而導(dǎo)致腫瘤易發(fā)[8,9]。

大腸癌惡性生物學(xué)特性的表達(dá)是依賴于多因素影響和多基因調(diào)控的,抑癌基因在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用日益受到重視。楊祖立等采用巢式雙重甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)和RT-PCR方法檢測(cè)120結(jié)直腸癌病例探討Syk基因啟動(dòng)子甲基化與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)120例結(jié)直腸癌患者中,48例未檢測(cè)到Syk mRNA的表達(dá),而癌旁正常組織均有表達(dá);37例腫瘤組織發(fā)生Syk基因啟動(dòng)子甲基化,癌組織Syk基因啟動(dòng)子甲基化顯著高于正常組織;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的56例中,24例發(fā)生Syk基因啟動(dòng)子甲基化,而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的64例中,13例發(fā)生甲基化,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Syk基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,而發(fā)生甲基化的腫瘤組織中均無SykmRNA的表達(dá),說明基因甲基化可以導(dǎo)致Sykm-RNA的表達(dá)缺失,進(jìn)而引起結(jié)直腸癌的侵襲性增強(qiáng),這可能是結(jié)直腸癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的又一種機(jī)制[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Syk cDNA的LoVo細(xì)胞比轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞倍增時(shí)間顯著延長(zhǎng),提示Syk基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過外源Syk基因mRNA水平的表達(dá),從而抑制人結(jié)腸腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

Syk在大腸癌中的作用機(jī)制、表達(dá)缺失的原因以及Syk如何抑制腫瘤細(xì)胞侵襲生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制等尚不清楚。有研究認(rèn)為HER 2的過度表達(dá)可以使內(nèi)皮細(xì)胞收縮,內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬,使腫瘤細(xì)胞易于從內(nèi)皮細(xì)胞穿越,從而易于使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。Syk與HER 2的作用相反,其抑制癌的轉(zhuǎn)移可能是通過拮抗HER2的作用,擴(kuò)張內(nèi)皮細(xì)胞,減少內(nèi)皮細(xì)胞間隙來實(shí)現(xiàn)。綜合上述研究表明Syk對(duì)大腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移可能有抑制作用,進(jìn)一步研究Syk基因的作用機(jī)制,可為大腸癌的治療提供新的思路。

[1]Stewart ZA,Pietenpol JA.Syk:a new player in the field of breast cancer[J].Breast Cancer Res,2001,3(1):5.

[2]TuenerM,Schweighoffer E,Colucei F,et al.Tyrosine kinase Syk,essential functions for immunorecep tor signaling[J].Imm unol Today,2000,21(3):148.

[3]Turner M,Mee PJ,Costello PS,et al.Perinatal lethality and blocked B-cell development in mice lacking the trrosine kinase Syk[J].Nature,1995,378(6554):298.

[4]Craxton A,Jiang A,Kurosaki T,et al.Syk and Bruton’styrosine kinase are required for B cell antigen receptor mediated activation of the kinase Akt[J].J Biol Chem,1999,274(43):30644.

[5]Goodman PA,Wood CM,Vassilev A,et al.Spleen tyrosine kinase(Syk)deficiency in childhood proB cell acute lymphoblastic leukemia[J].Oncogene,2001,20:3969.

[6]Zhu D,Tibbles H,Vassilev A,et al.SYK and LYN mediate Bcell receptorindependent calciuminduced apoptosis in DT40 lymphoma Bcells[J].Leuk Lymphoma,2002,43:2165.

[7]Coopman J,Do MT,Barth M,et al.The Syk tyrosine kinase suppresses malignant growth of human breast cancer cells[J].Nature,2000,406(6797):742.

[8]Sada K,Takano T,Yanagi S,et al.Structure and function of Sykproteintyrosine kinase[J].J Biochem(Tokyo),2001,130:177.

[9]Djeu J,Jiang K,Wei S.A view to a kill:signals triggering cytotoxicity[J].Clin CancerSykproteintyrosine kinase[J].J Biochem(Tokyo),2001,130:177186..Breast Cancer Res,2001,3(1):527.

[10]楊祖立,汪建平,元云飛,等.結(jié)直腸侵襲性與脾酪氨酸激酶基因Syk啟動(dòng)子甲基化的關(guān)系[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2005,22(1):68.