張 玲,郭曉雷,張秋影,佟青,曲成剛,施 維,韓智星,張桂榮*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科,吉林 長春130021;2.南航吉林分公司航衛(wèi)室,吉林 長春130031;3.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院生化教研室,吉林長春130021;4.吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長春130012)

利用單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原的選擇特 異性,對(duì)抗癌藥物進(jìn)行主動(dòng)靶向設(shè)計(jì)研究,可提高抗癌藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性,實(shí)現(xiàn)靶向治療,降低對(duì)正常器官的毒性。1958年,Mathe首次將抗鼠白細(xì)胞免疫球蛋白與甲氨蝶偶聯(lián)用于靶向治療,隨后出現(xiàn)了各種抗癌藥物與各種抗體的偶聯(lián)物。目前,抗體偶聯(lián)的靶向抗癌藥物研究正在成為生物技術(shù)藥物領(lǐng)域的新熱點(diǎn),并具有良好的前景。

本課題組采用活化酯法將抗癌化學(xué)藥紫杉醇與抗HER2單克隆抗體偶聯(lián),合成了免疫偶聯(lián)物(TAX-抗HER2MAb)靶向抗癌藥,本文以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為藥物作用對(duì)象,研究免疫偶聯(lián)物TAX-抗HER2MAb的體外抗腫瘤活性,為乳腺癌的靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

TAX-抗HER2MAb偶聯(lián)物為本課題組先期合成;人乳癌細(xì)胞株MCF-7由吉林大學(xué)生命科學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室提供;HER-2抗原Biovision;HRP-羊抗鼠IgG華特生生物技術(shù)有限公司;BSA Sigma產(chǎn)品;MTT Genview產(chǎn)品;RPMI-1640美國Hyclone產(chǎn)品;FCS杭州四季青生物工程材料公司;V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin;DYY-Ⅲ穩(wěn)壓穩(wěn)流高壓電泳儀(北京六一儀器廠);Tanon GLS-2010凝膠成像(上海天能);Horaues型二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO公司);ELTIE型流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司);BHZ型光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1MTT法檢測(cè)T AX-抗HER2MAb偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(正常培養(yǎng)的MCF-7乳癌細(xì)胞懸液)、試劑對(duì)照組(加DMSO)、TAX藥物組及偶聯(lián)物藥物組(設(shè)5個(gè)藥物濃度:1.28×10-2nmol/L、6.4×10-2nmol/L、3.2×10-1nmol/L、1.6 nmol/L、8 nmol/L),每組均設(shè)3個(gè)平行孔。

取對(duì)數(shù)生長期的乳癌MCF-7細(xì)胞,以0.25%胰蛋白酶消化1.5min,1 000 rpm離心5 min,沉淀細(xì)胞以RPMI-1640培養(yǎng)液制成5×104個(gè)濃度單細(xì)胞懸液,接種于 96 孔培養(yǎng)板,每孔 100 μ l,37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)24 h后,觀察細(xì)胞生長良好,換培養(yǎng)液;按實(shí)驗(yàn)分組向各孔加藥,置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng) 20h;每孔加 5 mg/ml的MTT 20 μ l,繼續(xù)培養(yǎng)4h終止培養(yǎng),吸去培養(yǎng)液,每孔加DMSO 150 μ l,振蕩使甲溶解,酶標(biāo)儀570 nm檢測(cè)各孔吸光度值(A值)。按[(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/腫瘤細(xì)胞對(duì)照組平均A值 )×100%]計(jì)算腫瘤細(xì)胞的生長抑制率;以藥物濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以細(xì)胞生長抑制率為縱坐標(biāo)繪制半對(duì)數(shù)曲線,計(jì)算半數(shù)抑制藥物濃度IC50。

1.2.2FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 實(shí)驗(yàn)分組:設(shè)陰性對(duì)照組(正常培養(yǎng)的MCF-7乳癌細(xì)胞)及加藥組(分設(shè)為1.6 nmol/L TAX組、1.6 nmol/L偶聯(lián)物組及1.6 nmol/L TAX+1.6 nmol/L單抗組)。

對(duì)數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞,0.25%的胰蛋白酶消化后,制備5×104/ml單細(xì)胞懸液接種于新培養(yǎng)瓶中,37℃,5%CO2培養(yǎng)24 h完全貼壁,把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi),PBS洗滌貼壁細(xì)胞,0.25%的胰蛋白酶液消化;加入上步收集的細(xì)胞培養(yǎng)液,混勻,轉(zhuǎn)移至離心管,1 000 rpm離心5min,收集細(xì)胞,用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)參照Annexin V-FITC試劑盒說明書操作程序操作。

取5-10萬個(gè)重懸的細(xì)胞,1 000 rpm離心5min,棄上清,加入 195 μ l Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞 ;加入 5 μ l Annexin V-FITC,輕輕混勻 ;室溫避光孵育10 min;1 000 rpm離心5 min,棄上清,加入190 μ l Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞;加入10 μ l PI染色液,輕輕混勻,冰浴避光放置;流式細(xì)胞儀檢測(cè)設(shè)空白對(duì)照組、PI空白對(duì)照組及Annexin VFITC空白對(duì)照組分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.3瓊脂糖凝膠電泳分析細(xì)胞基因組DNA TE飽和酚法分別提取TAX和偶聯(lián)物作用24h的腫瘤細(xì)胞DNA,瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.4Western-blot檢測(cè)細(xì)胞HER2蛋白表達(dá) 以濃度均為1.6 nmol/L的偶聯(lián)物及TAX分別加入培養(yǎng)24 h貼壁生長良好的MCF-7細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h,離心收集細(xì)胞;以細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞;10 000 rpm 4℃離心3 min,取上清;SDS-PAGE電泳,分離膠濃度15%,積層膠濃度5%,積層膠電壓8 V/cm,分離膠電壓14 V/cm,電泳時(shí)間根據(jù)溴酚藍(lán)指示?？捡R斯亮藍(lán)染液,脫色。電泳凝膠片按目的蛋白的位置切割并做出標(biāo)記放入轉(zhuǎn)移液中;半干式轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)PVDF膜,轉(zhuǎn)膜電流1 mA/cm2,1.5 h;麗春紅染色10 min;室溫去離子水漂洗PVDF膜,直至蛋白條帶消失;5%脫脂奶粉封閉,先后與一抗及HRP-羊抗鼠二抗反應(yīng),DAB顯色,攝像保存;β-Tubulin作內(nèi)參。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 MTT結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩兩均數(shù)之間的比較使用 t檢驗(yàn);以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)TAX-抗HER2MAb偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

對(duì)細(xì)胞的抑制作用TAX實(shí)驗(yàn)組與TAX-抗HER2MAb偶聯(lián)物實(shí)驗(yàn)組在相同藥物濃度時(shí),偶聯(lián)物組抑制率明顯高于TAX組,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見表2.1和圖2.1。半數(shù)抑制率藥物濃度(IC50)TAX組為6.00 nmol/L,偶聯(lián)物組為3.97 nmol/L,二者相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2.1 TAX-抗HER2MAb偶聯(lián)物與TAX對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長抑制率

表2.1 各組吸光度值與細(xì)胞生長抑制率(s)

表2.1 各組吸光度值與細(xì)胞生長抑制率(s)

*P＜0.05

分組 吸光度 抑制率DMSO溶劑對(duì)照組 0.1766±0.0023腫瘤細(xì)胞對(duì)照組 0.6656±0.0050紫杉醇組nmol/L 1.28×10-2 0.552 6±0.0047 0.198 2±0.012 5 6.4×10-2 0.531 0±0.0052 0.258 9±0.011 2 3.2×10-1 0.498 0±0.0010 0.335 1±0.009 0 1.28×10-2 0.492 3±0.004 00.327 0±0.007 8*6.4×10-2 0.469 3±0.001 50.385 6±0.006 0*3.2×10-1 0.450 3±0.003 70.433 7±0.012 0*

2.2 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),腫瘤細(xì)胞對(duì)照組即陰性對(duì)照組中細(xì)胞凋亡率為1.5%,TAX組細(xì)胞凋亡率為12.5%,TAX+抗HER2單抗組細(xì)胞凋亡率為13.9%,而偶聯(lián)物組細(xì)胞凋亡率為25.9%,圖2.2。

圖2.2 Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡率圖譜

2.3 瓊脂糖凝膠電泳分析凋亡細(xì)胞DNA

由圖2.3可以看出,經(jīng)TAX和偶聯(lián)物處理的MCF-7乳腺癌細(xì)胞均出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡DNA特征性梯狀條帶,偶聯(lián)物組較TAX組凋亡數(shù)多;對(duì)照組細(xì)胞基因組DNA比較完整。表明藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞有促進(jìn)凋亡作用,并且偶聯(lián)物組促凋亡效果明顯。

圖2.3 腫瘤細(xì)胞凋亡DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 Western-blot檢測(cè)細(xì)胞HER2蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)膜后內(nèi)參蛋白和HER2蛋白的免疫印跡圖譜如圖2.4。由圖可見HER2蛋白表達(dá)量偶聯(lián)物藥物組低于TAX組,TAX組低于對(duì)照組。

3 討論

隨著對(duì)惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展分子機(jī)制的深入研究,分子靶向治療在腫瘤的治療領(lǐng)域越來越受到重視。靶向藥物最顯著特點(diǎn)是能將藥物最大限度地運(yùn)送到靶區(qū),使藥物在靶區(qū)濃集,直接作用于病變組織、器官和細(xì)胞,延長藥物與靶部位的作用時(shí)間,從而減少用藥量和藥物的毒副作用[1]。根據(jù)藥物分子的大小,可將分子靶向抗腫瘤藥物分為大分子單克隆抗體類和小分子化合物類[2]。

圖2.4 Western-blot圖譜

單克隆抗體靶向藥物是利用單抗對(duì)腫瘤表面相關(guān)抗原特異性識(shí)別,把藥物直接導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞,提高藥物的療效,降低藥物對(duì)循環(huán)系統(tǒng)及其他部位的毒性。目前抗腫瘤單克隆抗體可以分為兩類:①單克隆抗體:單克隆抗體作為藥物能特異結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表面,通過直接的抗原-抗體反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡。1997年以來,美國FDA已先后批準(zhǔn)9種抗體藥物用于腫瘤治療。②抗腫瘤單克隆抗體偶聯(lián)物,又稱免疫偶聯(lián)物(immunoconjugate),即單克隆抗體與抗癌化學(xué)藥、毒素等的偶聯(lián)復(fù)合體。

紫杉醇(paclitaxel)系FDA于1992年12月批準(zhǔn)上市的抗癌藥,由于其抗癌譜廣、副作用相應(yīng)小于其他抗腫瘤藥物,已成為臨床上廣泛使用的首選抗癌藥物。紫杉醇抗癌作用機(jī)制比較復(fù)雜,現(xiàn)在普遍認(rèn)同的機(jī)制有:①微管穩(wěn)定作用;②免疫機(jī)制;③誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;④抑制腫瘤細(xì)胞遷移[3,4]。

HER2是跨膜受體,其胞外域信號(hào)分子結(jié)合部位與配體結(jié)合后被活化而引發(fā)相關(guān)信號(hào)分子級(jí)聯(lián)激活,進(jìn)而傳遞到胞內(nèi)靶分子而激活靶基因。HER2的基因過表達(dá)見于25%-30%的乳癌患者,也是乳癌發(fā)展進(jìn)程中最有用的分子預(yù)后指標(biāo)[5]。已經(jīng)證實(shí)HER2基因的致癌性是通過該基因的過表達(dá)。

HER2單克隆抗體能夠特異識(shí)別和結(jié)合HER2,進(jìn)而干擾由HER2介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,抑制有絲分裂、細(xì)胞周期、侵襲和轉(zhuǎn)移、血管形成及DNA修復(fù);另外HER2單克隆抗體具有增強(qiáng)乳癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性的作用[6,7,8]。

通過MTT法體外腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用表明TAX-抗HER2MAb偶聯(lián)物的作用高于單純的TAX,半數(shù)抑制率時(shí)藥物的濃度(IC50)TAX組為6.00 nmol/L,偶聯(lián)物組為3.97 nmol/L,即在達(dá)到相同抗腫瘤作用時(shí)用藥量可以減少20.3%。Western-blot檢測(cè)HER2蛋白表達(dá),偶聯(lián)物可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞HER2蛋白的表達(dá)量,闡明偶聯(lián)物可能阻斷了由HER2介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,使HER2基因的表達(dá)下調(diào)。FCM法細(xì)胞凋亡檢測(cè)及凋亡細(xì)胞基因組DNA檢測(cè)研究表明,偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制、誘導(dǎo)凋亡等作用比紫杉醇及紫杉醇+HER2單克隆抗體效果好,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本文通過體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究,初步證明TAX-抗HER2MAb偶聯(lián)物的抗腫瘤作用強(qiáng)于單純的 TAX、HER2單抗及 TAX+HER2單抗,為靶向藥物的合成及臨床應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]Wolff AC,Hammond ME,Schwartz JN,et al.AmericanSociety of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor Receptor 2 testing in breast cancer[J].Arch Pathol Lab Med,2007,131(1):18.

[2]李 娟,李延團(tuán),李曉明,等.分子靶向抗腫瘤藥物研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2009,20(3):411.

[3]Horowitz SB.Mechanism of action of taxol[J].Trends Pharmacol Sci,1992,13(4):134.

[4]Hu X Y,Meng G,BaoY Y,et al.Relationships between induction of apoptosis by Taxol in Hela cells and apoptosis-related proteins[J].Chin Pharmacol Bull,2004,20(9):1063.

[5]Robert N,Leyland-Jones B,Asmar L,et al.Randomized phaseⅢstudy of trastuzumab,paclitaxel,and carboplatin compared with trastuzumab and paclitaxel in women with HER-2-over expressing metastatic breast cancer[J].J Clin Oncol,2006,24(18):2786.

[6]劉 東,饒子超,陳兆聰.紫杉醇與抗HER2單抗Sc7301偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞株的體外殺傷效應(yīng)[J].中國醫(yī)藥學(xué)雜志,2007,27(7):10.

[7]XIE Jiang-wei,WANG Chi-hwa.Self-assembled biodegradable nanoparticles developed by direct dialysis for the delivery of paclitaxel[J].Pharm Res,2005,22(12):2079.