張明磊,常 非,高忠禮,柳 揚,劉光耀

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科,吉林長春130021)

骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)作為骨組織工程常用種子細胞之一,具有很強的成骨分化能力,在特定環(huán)境中可以被誘導分化為成骨細胞,促進骨修復過程。但其成骨速度、成骨效率、修復骨缺損的效果并不令人滿意[1]?；蛑委熂稗D(zhuǎn)基因技術的發(fā)展為解決這些問題提供了一條有效的道路,將編碼細胞因子的基因?qū)隑MSCs中,植入骨缺損部位,在局部持續(xù)產(chǎn)生細胞因子,以自分泌和旁分泌的方式誘導成骨。本實驗中將 BMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs,表達BMP-2,促進骨修復效應,為治療臨床上治療骨缺損奠定良好的基礎。

1 材料和方法

1.1材料pEGFP-N1/BMP-2真核表達質(zhì)粒(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科構(gòu)建),LIPofectamineTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Gibco公司),DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司),胎牛血清(美國Hyclone公司),SP免疫組化試劑盒、DAB(福州麥新生物技術有限公司),兔抗人BMP-2抗體(Santa Cruz)。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒的制備 將質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化保種菌液復蘇至室溫,各吸取 200 μ l至含有25 ml含 30 mg/ml的LB液體培養(yǎng)基中,37℃劇烈震蕩(1 000 rpm)培養(yǎng)24 h。將擴增菌液收集于50 ml離心管中,于4℃6 000 g離心15 min,棄去培養(yǎng)液,低溫干燥細菌沉淀。抽提、純化質(zhì)粒。-80℃低溫保存用于細胞轉(zhuǎn)染。

1.2.2BMSCs的培養(yǎng) 將液氮中凍存的BMSCs于42℃水中迅速復溫,轉(zhuǎn)移至75 ml培養(yǎng)瓶內(nèi),補充含10%低糖DMEM培養(yǎng)基至5 ml,在 37℃,含5%CO2的飽和濕度的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,待細胞貼壁后,立即更換新鮮培養(yǎng)液。細胞鋪滿瓶底達70-80%左右時采用胰酶消化法按1∶4傳代,觀察細胞生長狀態(tài)良好時,準備轉(zhuǎn)染。

1.2.3細胞的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天,采用胰酶消化法將處于對數(shù)生長期的細胞制備成單個細胞液,計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為2×105細胞/ml,接種于6孔板,每孔2ml。次日細胞融合鋪滿板底80%左右時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染采用LIPofect-amineTM試劑盒進行。

1.2.4轉(zhuǎn)染后的觀察及計算轉(zhuǎn)染率 細胞轉(zhuǎn)染48小時,光鏡和熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染后熒光表達情況。熒光顯微鏡觀察:將蓋玻片在熒光顯微鏡下,激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長507 nm熒光顯微鏡下直接觀察細胞中綠色熒光強度及可顯示綠色熒光細胞的比例,以此了解質(zhì)粒在BMSCs的表達情況。

轉(zhuǎn)染效率計算:在100倍下測量10個均勻分布的視野,并計算每個視野內(nèi)的細胞總數(shù)和轉(zhuǎn)染陽性細胞數(shù):10個視野轉(zhuǎn)染陽性細胞樹之和/細胞總數(shù)之和=該孔細胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5ELISA方法檢測BMP-2的表達 參照試劑盒說明 ,分別于1 d 、4 d、7 d、10 d、15 d、21 d 采用ELISA方法檢測轉(zhuǎn)染了各組質(zhì)粒的BMSCs培養(yǎng)液中BMP-2蛋白的表達。

1.2.6免疫組織化學染色分析BMP-2、I型膠原、ALP及骨鈣素 將細胞以1×105/mL、2mL/孔,接種于鋪有經(jīng)多聚賴氨酸處理過的蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h。PBS輕洗3次,4%的多聚甲醛4℃固定,血清封閉,室溫孵育 10 min。傾去血清,滴加抗體,滴加50 μ L生物素標記的 1∶100稀釋的二抗,37℃孵育 30 min,PBS沖洗,滴加 50 μ L新配置的DAB顯色劑溶液,顯色后,自來水沖洗,蘇木素復染。梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下觀察

熒光顯微鏡下觀察,pEGFP-Nl/BMP2轉(zhuǎn)染組發(fā)出綠色熒光。通過計算,轉(zhuǎn)染率為38.4%。

2.2 ELISA方法檢測BMP-2

結(jié)果顯示正常BMSCs及BMP-2轉(zhuǎn)染組均有目的蛋白的分泌,對兩組組間進行統(tǒng)計學分析,BMP-2轉(zhuǎn)染組與正常細胞有顯著性差別(P＜0.05)。

表1 各組平均BMP-2(pg/ml)

2.3 免疫組化染色

顯微鏡下觀察,轉(zhuǎn)染組細胞中均可見深棕黃色染色。提示BMP-2基因轉(zhuǎn)染后在細胞中表達目的基因,并促進成骨方向轉(zhuǎn)化。見圖1。

3 討論

圖1 A.BMP-2免疫組化染色;B.ALP免疫組化染色;C.I型膠原免疫組化染色;D.骨鈣素免疫組化染色(×200)

1965年Urist[1]報道將脫鈣骨基質(zhì)植入同種動物的肌肉內(nèi),結(jié)果可誘導異位新骨形成,后來DBM經(jīng)進一步分離提純被證明是蛋白質(zhì)分子,因此命名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白,并證明了骨誘導學說。研究證實,BMPs是一組同源二聚體蛋白,為疏水性、酸性糖蛋白,由半胱氨酸結(jié)合的兩條特異性鏈組成,分子量約30 kD。1988年 Wozney[2]等報道了人 BMP-1、BMP-2A、BMP-2B(BMP-4)和BMP-3的CDNA 克隆及表達,此后,學者們在這方面進行了大量的研究工作,到目前為止,已發(fā)現(xiàn)至少存在21種BMPs亞型。其中,BMP-2的研究較為廣泛和深入,并被認為是誘導成骨活性最強,其對細胞的作用主要是促進細胞分化[3],能明顯誘導從骨髓中分離得到的多潛能干細胞向軟骨細胞、骨細胞分化,并且抑制其向脂肪細胞、肌細胞的分化方向。研究已證實BMP在植入局部的聚集比BMP的總劑量更重要,且BMP的劑量必須超過一個閾值才能有效誘導骨形成。在外傷骨折應用的劑量濃度為1.5 mg/mL,而低濃度無效[4]。體內(nèi)、體外研究顯示,BMSCs轉(zhuǎn)染 BMP-2基因后,比單純應有化學物誘導干細胞的成骨作用更明顯。

在骨形成的過程中會產(chǎn)生許多骨代謝的生化標志物,這些能夠直接反應骨性成的特異性指標被稱為骨形成標記。常用的指標有I型膠原、堿性磷酸酶和骨鈣素。I型膠原占骨組織有機成分中90%,是主要的骨結(jié)構(gòu)蛋白。堿性磷酸酶是成骨細胞早期分化的標志,骨鈣素(OC)的出現(xiàn)標志著成骨細胞的成熟。通過分析ALP、I型膠原和骨鈣素的表達可以反應骨的形成過程。

骨組織中含有大量的ALP,存在于成骨細胞周圍及其表面,ALP主要定位于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)、高爾基體、胞漿膜及核膜上,是骨代謝的重要蛋白質(zhì),在礦化過程中起非常重要的作用,鈣化多發(fā)生在ALP陽性區(qū)。極易釋放入血,因而當成骨細胞增殖、骨生長亢進時會出現(xiàn)血清ALP活性上升。ALP的高表達是成骨細胞早期分化的標志[5]。

骨鈣素又稱為骨γ-羧基谷氨酸蛋白(bone carboxyglutamic acid Protein,BGP),占骨組織中非膠原蛋白的10-20%,是成骨細胞合成和分泌的特異性產(chǎn)物,為成骨細胞分化成熟的標志,反映了成骨細胞的成骨能力[6]。

本實驗成功的利用脂質(zhì)體將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入BMSCs,目的基因可以持續(xù)高表達,在生物化學和組織化學上,轉(zhuǎn)染后的BMSCs具有富含ALP,可合成I型膠原,并且分泌骨鈣素等典型特征,是廣泛采用的成骨細胞鑒定標準,并作為成骨作用和代謝調(diào)節(jié)的評價指標[7]。通過免疫組化染色的方法證明,轉(zhuǎn)染后的細胞向成骨方向分化。為利用BMP-2基因促進骨組織修復提供了實驗基礎。

[1]Urist MR.Bone formation by autoinduction[J].Science,1965,150(698):893.

[2]Wozney JM,Rosen V,Celeste AJ,et al.Novel regulators of bone formation:molecular clones and activities[J].Science,1988,242(4885):1528.

[3]Noden DM.Factors and mechnaisms influencing bone growth[M].New York:Alan.R.liss.1982:167.

[4]Mussano F,Ciccone G,Ceccarelli M,et al.Bone morphogenetic proteins and bone defects:a systematic review[J].Spine,2007,32(7):824.

[5]Jin YJ,Lien WH,Jsa WC,et al.Distinct regulation of genes by bFGF and VEGF-A in endothelial cells[J].Angiogenesis,2001,4(4):313.

[6]Marie PJ,Connes D,Hott M,et al.Comparative effects of a novel vitamin D analogne Mc-903 and 1.25-dihydroxy vitamin D3 on alkaline phosphatasea activity,osteocalcin and DNA synthesis by human osteblastic cell in culture[J].Bone,1990,1(3):171.

[7]Alborzi A,Nac-KG,Lackin CA,et al.Endochondral and intramenbranous fetal bone development:osteoblastic cell proliforation and expressing of alkaline phosphatase,mtwist and histone H4[J].J Crnaifac Genet Dev Biol,1996,16(2):94.