趙丹彤,閆惠平*,廖慧鈺,趙 艷,劉燕敏,劉 妍,黃云麗,馮 霞,孔祥沙

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院自身免疫性肝病臨床研究中心,北京100069;2.首都醫(yī)科大學 臨床檢驗診斷學系,北京100050)

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一種原因不明的以血清中出現(xiàn)高滴度抗線粒體抗體(antimitochondrial autoantibodies,AMAs)及自身免疫介導的肝內小膽管進行性破壞和炎細胞浸潤為主要特點的自身免疫性肝病,現(xiàn)已證實PBC患者肝組織和外周血中存在自身反應性T細胞[1]。T細胞亞群檢測可用于評價機體免疫功能,我們對86例肝硬化期PBC患者外周血淋巴細胞計數(shù)及T細胞亞群結果進行回顧性分析,從定量角度探討肝硬化階段PBC患者外周血淋巴細胞總數(shù)及T細胞亞群特點并分析影響因素及臨床意義。

1 材料與方法

1.1研究對象2003年6月至2008年12月間北京佑安醫(yī)院住院PBC患者86例。其中,女性71例,年齡29-83歲,平均58.3±12.2歲。PBC患者的一般資料和臨床表現(xiàn),見表1。

1.2診斷標準PBC診斷標準符合2000年美國肝病學會制定的PBC診斷指導建議[2],包括:(1)ALP等反映膽汁淤積的生物化學指標升高;(2)B超或膽管造影檢查顯示膽管正常;(3)AMA或AMA-M2陽性;(4)如血清AMA或AMA-M2陰性,病理學檢查需符合PBC的改變。同時排除病毒性肝炎,酒精性、藥物性肝損害及原發(fā)性肝癌。

1.3分組本次研究對象均為進展至肝硬化階段的PBC患者,相當于PBC自然史中的癥狀期及出現(xiàn)肝硬化失代償?shù)母嗡デ捌赱3]。根據(jù)肝硬化程度和臨床表現(xiàn),將PBC患者分為代償期組和失代償期組。代償期組主要為肝功能異常伴有乏力、皮膚瘙癢等臨床表現(xiàn)的PBC癥狀期患者;失代償期組為出現(xiàn)腹水、黃疸、靜脈曲張和上消化道出血等肝硬化失代償表現(xiàn)的PBC患者。其中,代償期患者40例,失代償期患者46例。

1.4方法

1.4.1肝功及免疫學指標檢測 丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉肽酶(GGT)、總膽紅素(TBil)、白蛋白(ALB)采用日本Olympus AU5400全自動生化分析儀檢測;血清總 IgG、IgA、IgM 采用Array 360全自動分析儀檢測。

1.4.2自身抗體檢測 采用間接免疫熒光法檢測自身抗體譜,免疫印跡法檢測AMA-M2。試劑購自德國歐盟公司。

1.4.3血常規(guī)檢測 外周血白細胞計數(shù)(WBC)、淋巴細胞計數(shù)(LYMPH)、淋巴細胞百分比(LYMPH%)等參數(shù)采用日本Sysmex XE-2100五分類全自動血細胞分析儀檢測。

1.4.4外周血T細胞亞群檢測 T細胞絕對數(shù)(CD3+)、T輔助細胞百分比(CD3+CD4+%)、T輔助細胞絕對數(shù)(CD3+CD4+)、T抑制細胞百分比(CD3+CD8+%)、T抑制細胞絕對數(shù)(CD3+CD8+)和T輔助細胞比T抑制細胞(CD4+/CD8+)檢測采用美國BD公司FACSCalibur流式細胞儀,抗體選用BD公司3色熒光抗體TriTEST CD3PerCp/CD4FITC/CD8PE,單平臺法,前向和側向散射光設門;絕對計數(shù)采用BD trucount tubes,裂解紅細胞為FACS Lysing法,根據(jù)廠家提供的操作規(guī)程檢測。

1.4.5Mayo評分模型[4]R=0.871×loge[0.058×膽紅素(μ ol/L)]-2.53×loge[0.1×白蛋白(g/L)]+0.039×[年齡(歲)]+2.38×loge[凝血酶原時間(s)]+0.859×(水腫積分)。水腫積分:無水腫,0分;水腫可控制,0.5分;水腫難控制,1分。

1.5統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析,正態(tài)分布定量資料以均數(shù)±標準差(s)表示,采用獨立樣本t檢驗進行組間比較;偏態(tài)分布定量資料以Median(Range)表示,采用Wilcoxon秩和檢驗;計數(shù)資料用行×列 χ2檢驗;偏態(tài)分布定量資料或分類變量資料采用Spearman秩相關分析法,P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1臨床、生化及免疫學特點46例肝硬化失代償期PBC患者中有4例(8.7%)出現(xiàn)上消化道出血、36例(78.3%)出現(xiàn)腹水,8例(17.4%)出現(xiàn)肝性腦病;40例代償期PBC患者有26例(65.0%)伴脾大或脾切除。失代償期患者平均年齡、黃疸比例、脾大或脾切除比例、TBil、IgA 、Mayo評分高于代償期患者(P＜0.05),而ALT、ALB 低于代償期患者(P ＜0.05);女性比例、皮膚瘙癢、乏力等PBC常見臨床特點兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義;AST、ALP、GGT、IgG 、IgM、ANA陽性率、AMA-M2陽性率兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表1、2。

2.2外周血淋巴細胞計數(shù)與T細胞亞群檢測肝硬化代償期 PBC患者 LYMPH、LYMPH%、CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+結果均高于失代償期患者(P ＜0.05);WBC、CD3+CD4+%、CD3+CD8+%、CD4+/CD8+兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表3。

2.3外周血淋巴細胞計數(shù)及T細胞亞群結果正常與異?；颊哳l率根據(jù)外周血淋巴細胞計數(shù)正常參考值范圍,進一步將檢測結果分為減低、正常、增高三種情況,比較代償期和失代償期相應指標正常與異?；颊哳l率。在LYMPH、LYMPH%、CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+檢測結果中,失代償期減低者頻率均高于代償期,失代償期增高者頻率均低于代償期,各指標結果正常與異?；颊邩嫵杀葍山M間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見表4。

表1 PBC肝硬化期患者一般資料、臨床表現(xiàn)及比較

表2 PBC肝硬化期患者肝功、免疫學特點及比較

表3 PBC肝硬化期患者外周血淋巴細胞計數(shù)結果及比較

2.4外周血淋巴細胞計數(shù)與T細胞亞群影響因素在可能的影響因素中,年齡、Mayo評分、上消化道出血、脾大或脾切除、腹水等肝硬化失代償表現(xiàn)對結果影響呈負相關;而ALT、ALB對結果影響呈正相關,見表5。

表4 PBC肝硬化期外周血淋巴細胞計數(shù)結果正常與異?；颊哳l率及比較

表5 PBC肝硬化期患者外周血淋巴細胞計數(shù)主要影響因素及相關性

3 討論

PBC多累及女性,具有遺傳易感性,90%患者血清中可檢測到AMAs,但自身抗體的致病機制仍未被證實[5]。隨著對AMAs陰性PBC的認識以及發(fā)現(xiàn)PBC患者淋巴細胞浸潤小膽管及肝組織[6],人們發(fā)現(xiàn)PBC患者存在細胞免疫反應的異常[7]。T細胞亞群檢測可從定量角度評價機體免疫水平、特別是評估免疫缺陷患者的細胞免疫水平。PBC患者的細胞免疫狀態(tài)受多種因素影響,縱向比較肝硬化代償期和失代償期PBC患者細胞免疫水平比橫向比較PBC患者和健康對照者更有臨床意義。劉海英等[8]分析了51例PBC患者淋巴細胞亞群百分比,未發(fā)現(xiàn)不同臨床分期PBC患者間差異有統(tǒng)計學意義,據(jù)此認為常規(guī)的細胞免疫檢測如T細胞亞群分析對病情或疾病階段的判斷幫助不大。本研究在擴大樣本量的基礎上,首先比較了肝硬化代償期和失代償期PBC患者臨床、生化和免疫學特點,發(fā)現(xiàn)肝硬化代償期患者平均年齡、TBil、IgA及Mayo評分低于失代償期患者,而ALT、ALB高于失代償期患者。Mayo評分是美國Mayo Clinic Center建立的用于預測PBC患者生存率的評分模型,可以無需肝穿預測PBC患者預后,包括年齡、血清膽紅素水平、白蛋白水平、凝血酶原時間和水腫程度,評分越高預后越差,而評分＞7.8被認為是進行肝移植的最佳時機[4,9,10],本研究中失代償期PBC患者Mayo評分明顯高于代償期PBC患者,說明失代償期PBC患者肝功損害更嚴重,由于肝細胞大量壞死或出現(xiàn)肝纖維化,肝臟產(chǎn)生轉氨酶能力逐漸喪失、合成ALB水平逐漸下降。

本研究發(fā)現(xiàn),代償期PBC患者外周血LYMPH、LYMPH%、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+結果高于失代償期患者。雖然兩組患者上述結果均數(shù)均在正常參考值范圍內,但不能據(jù)此認為PBC患者淋巴細胞計數(shù)和亞群分類計數(shù)與健康人之間沒有差別。為了排除樣本構成對結論的影響,進一步將每組患者檢測結果分為減低、正常、增高三種情況,對每種結果頻數(shù)分布進行多組間比較,發(fā)現(xiàn)代償期外周血淋巴細胞計數(shù)和亞群分類計數(shù)結果正?；蛟龈叩幕颊哳l率較高,而失代償期上述結果正常或減低的患者頻率較高,說明代償期患者外周血淋巴細胞計數(shù)和亞群分類計數(shù)以正?；蛏邽橹?失代償期患者以正?；驕p低為主。

PBC雖然為器官特異性自身免疫病,細胞免疫和/或體液免疫亢進會導致靶器官功能障礙,但患者整體免疫水平受多種因素影響。研究發(fā)現(xiàn),年齡、Mayo評分、上消化道出血、脾大或脾切除、腹水等肝硬化失代償表現(xiàn)與結果呈負相關,即隨著年齡的增長及肝硬化程度的加深,PBC患者淋巴細胞總數(shù)及T細胞亞群分類計數(shù)減少。ALT、ALB與結果呈正相關,不難理解,隨著肝硬化的程度加深,肝臟合成ALB水平逐漸下降,淋巴細胞總數(shù)及亞群分類計數(shù)呈平行降低;ALT在PBC早期可反映肝細胞損害程度,此時外周血淋巴細胞及肝臟侵潤淋巴細胞增加,肝組織局部免疫反應增強,而到肝硬化階段,由于肝細胞大量壞死或出現(xiàn)肝纖維化,肝臟產(chǎn)生轉氨酶能力逐漸喪失,此時淋巴細胞總數(shù)及T細胞亞群分類計數(shù)也呈平行降低。

在肝硬化門脈高壓時,由于大量的血細胞在腫大的脾臟中停留而被巨噬細胞所破壞,出現(xiàn)白細胞、紅細胞、血小板等血細胞減少的脾功能亢進表現(xiàn),為了緩解癥狀,使血象正?；蚪咏?患者通常進行脾切除。脾臟是不僅是重要的儲血器官,也是重要的免疫器官,脾切除雖然可以暫緩癥狀,但脾臟過濾功能消失,IgM減少、調節(jié)素和調理素水平降低、T淋巴細胞系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂、外周血淋巴細胞數(shù)量以及淋巴細胞轉換率明顯下降,導致爆發(fā)感染的機會顯著增加,因此,脾大可能是肝硬化失代償期患者免疫功能異常的重要原因之一[11],也是影響肝硬化期PBC患者外周血淋巴細胞總數(shù)及T細胞亞群分類計數(shù)結果的重要因素。

本研究的PBC患者多數(shù)為初次診斷時就已發(fā)展到肝硬化代償期,平均肝病史為2.5年,受規(guī)范治療的人少,而失代償期患者平均肝病史為4年,多數(shù)患者已接受或正在接受熊去氧膽酸(UDCA)的治療,而UDCA具有促進肝細胞分泌膽汁酸和免疫調節(jié)的作用。汪群英等[12]對23例PBC患者治療前后T細胞表型變化進行了比較,發(fā)現(xiàn)CD4+、CD4+/CD8+指標治療后比治療前明顯下降,但CD8+T細胞無明顯變化。因此,不能排除失代償期PBC患者淋巴細胞分類計數(shù)結果相對減低與治療無關。外周血淋巴細胞亞群檢測可從定量角度考察PBC患者,特別是疾病進展期患者的細胞免疫水平,若能結合患者病情和治療狀況對淋巴細胞功能進行體外研究,將有助于PBC患者免疫狀態(tài)的綜合評價,這對指導治療及提高患者生存質量有一定的意義。

[1]Ishibashi H,Nakamura M,Shimoda S,GershwinME.T cell immunity and primary biliary cirrhosis[J].Autoimmun Rev,2003,2:19.

[2]Heathcote E J.Management of primary biliary cirrhosis.The AmericanAssociation for the Study of Liver Diseases practice guidelines[J].Hepatolgy,2000,31:1005.

[3]Gershwin ME,Vierling JM,Manns MP.Liver Immunology:principles and practice[M].NY:Humana Press,2007.235-247.

[4]Dickson ER,Grambsch PM,Fleming TR,Fisher LD,Langworthy A.Prognosis in primary biliary cirrhosis:model for decisionmaking[J].Hepatology,1989,10:1.

[5]GershwinME,Ansari AA,Mackay IR,et al.Primary biliary cirrhosis:an orchestrated immune response against epithelial cells[J].Immunol Rev,2000,174:210.

[6]Dienes H P,Lohse A W,Gcrken G,et al.Bile duet epithelia as target cells in primary biliary cirrhosis and primary scleroaing cholangitis[J].Vimhows Arch,1997,431:119.

[7]閆惠平,莊 輝,劉燕敏,等.原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的免疫學特點分析[J].中華肝臟病雜志,2005,13:12.

[8]劉海英,鄧安澎,朱 燁,等.原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血臨床免疫指標分析[J].廣東醫(yī)學,2006,27:984.

[9]Klion FM,Fabry TL,PalmerM,Schaffner F.Prediction of survival of patients with primary biliary cirrhosis.Examination of the Mayo Clinic model on a group of patients with known endpoint[J].Gastroenterology,1992,102:310.

[10]KimWR,Wiesner RH,Therneau TM,et al.Optimal timing of livertransplantation for primary biliary cirrhosis[J].Hepatology,1998,28:33.

[11]張友才,鄧長生,朱尤慶,等.肝硬化脾大部分栓塞對T細胞亞群及sIL-2R水平影響及臨床意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志.2001,11:4.

[12]汪群英,徐蕓,李建生,等.原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血T細胞表型及細胞因子的變化及意義[J].臨床薈萃,2008,23:477.