蔡篤雄,陳衛(wèi)昌,曾仕平,湯 凈,林尤冠

(1.海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,海口570102;2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科,蘇州215006)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是臨床上常見(jiàn)的危重疾病,病情進(jìn)展迅速,早期容易并發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),死亡率高。因此,早期干預(yù)治療防止急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)由輕型向重癥發(fā)展成為目前重要的研究課題。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠SAP模型,并給予N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)預(yù)處理及氫化可的松治療,以探討NAC及氫化可的松對(duì)SAP的治療保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠72只,清潔級(jí),體重200～250g,由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。牛磺膽酸鈉(95%)購(gòu)自Sigma公司,IL-6試劑盒購(gòu)自Bender Medsystems公司,TNF-α試劑盒購(gòu)自北京晶美生物工程公司,組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,TNF-α及β-actin引物由上海生工生物工程公司合成,N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)購(gòu)于上海源聚生物科技公司,氫化可的松琥珀酸鈉注射劑購(gòu)自天津市生物化學(xué)制藥廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型的制備 72只SD大鼠隨機(jī)分為4個(gè)組。(1)SAP組:18只,參照錢明平等[1]的制模方法以0.1 mL/3min的速度向胰膽管內(nèi)逆行注入5%牛磺膽酸鈉(1mL/kg)建立大鼠SAP模型。大鼠SAP的診斷以病理檢查胰腺組織出現(xiàn)腺泡細(xì)胞的變性壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及胰腺周圍出血為標(biāo)準(zhǔn)并參照Schmidt的病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。(2)NAC處理組:18只,于模型制作前30min腹腔內(nèi)注射5%NAC(200mg/kg)進(jìn)行預(yù)處理。(3)氫化可的松治療組:18只,于SAP模型制作成功后10min給予舌下靜脈注射氫化可的松琥珀酸鈉(10mg/kg)。(4)假手術(shù)(SO)組:18只,開(kāi)腹后僅翻動(dòng)胰腺,即關(guān)腹。各組分別于術(shù)后3、6h和12h腹主動(dòng)脈抽血(各組每時(shí)點(diǎn)6只),分離血漿保存于-20℃中備測(cè),將大鼠處死,留取胰頭部胰腺組織并分為兩部分,一部分用10%甲醛固定,用于光鏡組織病理學(xué)檢查,另一部分快速置液氮中保存,用于提取組織勻漿檢測(cè)組織MPO;留取肺組織,右上肺組織用10%甲醛固定,用于光鏡組織病理學(xué)檢查,剩余肺組織分3部分置液氮中保存,右下肺組織用于提取組織勻漿檢測(cè)組織MPO,左上肺組織用于檢測(cè)肺濕/干比值,左下肺組織用于檢測(cè)肺組織中TNF-α mRNA的表達(dá)。

表1 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)血漿 AM Y、TNF-α、IL-6水平、胰腺及肺組織MPO的水平、肺濕/干比值、肺組織TNF-α mRNA的表達(dá)水平及胰腺組織病理學(xué)評(píng)分

1.3 觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

1.3.1 血漿淀粉酶采用全自動(dòng)生化分析儀(Olympus AU-2700)檢測(cè),血漿 TNF-α、IL-6采用ELISA方法檢測(cè),嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.2 胰腺及肺組織MPO 采用酶化學(xué)法測(cè)定,以每克組織濕片在37℃的反應(yīng)體系中 H2O2被分解1μ mol為 1個(gè)酶活力單位,MPO(單位/克濕片)=〔測(cè)定管吸光度(A)值-對(duì)照管A值〕/(11.3×取樣量),該指標(biāo)反映組織中中性粒細(xì)胞的聚集程度。

1.3.3 肺組織濕干比值測(cè)定 將左下肺組織從液氮中取出后稱濕重,然后將肺組織置于60℃烘箱內(nèi)烘烤72h,去除水分,取出稱干重,所得的數(shù)值為肺干重,肺濕/干比值為肺濕重/肺干重,該指標(biāo)反映肺水腫的程度。

1.3.4 病理學(xué)檢查及評(píng)分 胰腺及肺組織經(jīng)10%甲醛固定、石臘包埋、HE染色后于光鏡下觀察,并根據(jù)Schmidt等的病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胰腺組織進(jìn)行評(píng)分。

1.3.5 肺組織TNF-αmRNA的表達(dá) 采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè),PCR反應(yīng)條件分別為β-actin:94℃×30s,60℃×30s,72℃×30s;TNF-α:94℃×30s,60℃×30s,72℃×30s共30個(gè)循環(huán),結(jié)束前72℃×7min以充分延伸。TNF-α引物序列如下:TNF-α(312bp)正義 5′-CTC AAA GAC AAC CAA CTG GTG GTA C-3′,反義 5′-ACA GAG CAA TGA CTC CAA AGT AGA CC-3′,以β-actin(219bp)為內(nèi)參照,用 TNF-α/β-actin的光密度比值作為肺組織 TNF-α mRNA表達(dá)量的測(cè)定指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1 血漿淀粉酶、TNF-α、IL-6水平 SAP組各時(shí)間點(diǎn)血漿淀粉酶水平均較SO組顯著升高(P＜0.01),NAC處理組各時(shí)間點(diǎn)血漿淀粉酶均較SAP組明顯降低(P＜0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氫化可的松治療組各時(shí)間點(diǎn)血漿淀粉酶水平均較SAP組降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)表 1。SAP組各時(shí)間點(diǎn)血漿 TNF-α、IL-6水平均明顯高于 SO組(TNF-α:3h時(shí) P＜0.05,6、12h時(shí)P＜0.01;IL-6:3、6h時(shí) P＜0.05,12h時(shí)P＜0.01),NAC處理組各時(shí)間點(diǎn)血漿TNF-α水平及3、6h時(shí)IL-6水平均較SAP組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但12h時(shí)IL-6水平與SAP組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。氫化可的松治療組各時(shí)間點(diǎn)血漿 TNF-α、IL-6水平均較SAP組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 胰腺及肺組織M PO水平 SAP組各時(shí)間點(diǎn)胰腺及肺組織MPO水平均明顯高于SO組(胰腺M(fèi) PO:3h時(shí) P＜0.05,6、12h時(shí)P＜0.01,肺組織 MPO:3h時(shí) P＜0.05,6、12h時(shí) P＜0.01),NAC處理組各時(shí)間點(diǎn)胰腺及肺組織M PO水平均較SAP組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。氫化可的松治療組各時(shí)間點(diǎn)胰腺M(fèi)PO水平與SAP組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),各時(shí)間點(diǎn)肺組織M PO水平均較SAP組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 肺組織濕/干比值 SAP組 6、12h肺組織濕/干比值均明顯高于SO組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),NAC處理組及氫化可的松治療組6、12h肺組織濕/干比值均明顯低于SAP組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),NAC處理組及氫化可的松治療組各時(shí)間點(diǎn)與SO組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.4 肺組織中TNF-αmRNA的表達(dá) SO組肺組織中 TNF-α mRNA呈微弱表達(dá),SAP組各間點(diǎn)肺組織TNF-αmRNA表達(dá)水平均較SO組明顯增加(P＜0.01),NAC處理組及氫化可的松治療組各時(shí)間點(diǎn)肺組織中TNF-αmRNA的表達(dá)水平均較SAP組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表 1、圖1)。

2.5 胰腺及肺組織病理改變 SO組光鏡下胰腺組織基本正常,SAP組可見(jiàn)胰腺腺泡水腫及腺泡結(jié)構(gòu)消失,葉間隔、小葉間隔及腺泡間隔顯著增寬,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),腺泡細(xì)胞呈不同程度變性壞死,胰腺周圍出血,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),病變呈進(jìn)行性加重。NAC處理組各時(shí)間點(diǎn)胰腺水腫、出血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均較SAP組減輕,少數(shù)偶見(jiàn)局灶性腺泡細(xì)胞變性壞死,氫化可的松治療組胰腺水腫、出血、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)仍較明顯,各時(shí)間點(diǎn)與SAP組比較未見(jiàn)明顯減輕。病理學(xué)評(píng)分:SAP組各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織病理學(xué)評(píng)分均顯著高于SO組(P＜0.01),NAC處理組6、12h胰腺組織病理學(xué)評(píng)分均明顯低于SAP組(P＜0.05),氫化可的松治療組各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織病理學(xué)評(píng)分與SAP組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表1)。SO組光鏡下肺組織無(wú)明顯變化,SAP組可見(jiàn)肺泡壁水腫,肺間質(zhì)及肺泡腔有大量中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺內(nèi)可見(jiàn)散在出血灶,肺血管內(nèi)可見(jiàn)血栓形成,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),病變逐漸加重。NAC處理組及氫化可的松治療組各時(shí)間點(diǎn)肺泡壁、肺間質(zhì)水腫均較SAP組減輕,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,肺泡結(jié)構(gòu)基本正常,肺內(nèi)未見(jiàn)出血灶。

圖1 4個(gè)組大鼠各時(shí)點(diǎn)肺組織TNF-α mRNA的表達(dá)電泳圖

圖2 各組6h時(shí)胰腺組織的病理改變(HE×100)

圖3 各組12h時(shí)肺臟組織的病理改變(HE×100)

3 討 論

重癥急性胰腺炎(SAP)的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,研究表明,重癥急性胰腺炎由于眾多炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而導(dǎo)致 SIRS和并發(fā)急性肺損傷,其中 TNF-α、IL-6在SAP的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用[2],早期對(duì)SAP發(fā)病過(guò)程中的 TNF-α、IL-6進(jìn)行干預(yù)對(duì)SAP具有重要的治療保護(hù)作用[3]。

TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄、合成受核因子-κ B(NF-κ B)的調(diào)控,在SAP時(shí)大量的氧自由基激活 NF-κ B,并進(jìn)一步激活I(lǐng)L-1、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄、合成,促進(jìn)細(xì)胞因子的大量生成,從而導(dǎo)致SIRS和 MODS。Hyeyoung等[4]研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)用抗氧化劑NAC能抑制大鼠AP時(shí)胰腺組織NF-κ B的激活,使胰腺細(xì)胞內(nèi)上述細(xì)胞因子表達(dá)顯著降低,從而改善AP的病情。另外,動(dòng)物研究表明,給予氫化可的松預(yù)處理或治療后能顯著降低SAP時(shí) TNF-α、IL-6水平,明顯提高動(dòng)物生存率[5]。本實(shí)驗(yàn)中,SAP組血漿 TNF-α、IL-6水平顯著升高,給予 NAC預(yù)處理及氫化可的松治療能顯著降低血漿TNF-α、IL-6水平,結(jié)果表明,NAC及氫化可的松可通過(guò)減少TNF-α、IL-6的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎癥效應(yīng),改善SAP的病情。

研究發(fā)現(xiàn),SAP時(shí)肺組織中TNF-αmRNA呈現(xiàn)強(qiáng)烈與持久的表達(dá),TNF-αmRNA的表達(dá)水平與肺損害程度呈正相關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)中,SAP組肺組織TNF-αmRNA的表達(dá)顯著增加,NAC處理組及氫化可的松治療組肺組織TNF-αmRNA表達(dá)水平均較SAP組顯著降低,肺組織病理?yè)p傷較SAP組明顯減輕,表明給予NAC預(yù)處理及氫化可的松治療對(duì)SAP肺損傷可能具有重要的治療保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)中,給予NAC預(yù)處理能顯著降低SAP時(shí)胰腺及肺組織MPO水平,明顯降低肺濕/干比值,并能明顯減輕胰腺及肺組織的病理?yè)p傷,表明給予NAC預(yù)處理能明顯減輕胰腺及肺組織中中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn),減輕胰腺及肺組織的炎癥反應(yīng),改善SAP時(shí)胰腺及肺組織損傷。另外,給予氫化可的松治療能顯著降低SAP肺組織中M PO的水平及肺組織濕/干比值,并能明顯減輕各時(shí)間點(diǎn)肺組織的病理?yè)p傷,提示給予氫化可的松治療能明顯減輕肺組織炎癥反應(yīng)及肺水腫,改善肺組織損傷。但在本實(shí)驗(yàn)中,氫化可的松治療組血漿淀粉酶水平、胰腺組織MPO水平、胰腺組織病理學(xué)評(píng)分與SAP組比較均無(wú)明顯差異,胰腺組織病理?yè)p傷與SAP組相比未見(jiàn)明顯減輕,說(shuō)明氫化可的松治療并不能改善SAP時(shí)胰腺組織的病理?yè)p傷。

綜上所述,NAC及氫化可的松可通過(guò)減少細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生,改善 SAP的病情,早期應(yīng)用抗氧化劑及激素進(jìn)行干預(yù)對(duì)重癥急性胰腺炎具有一定的治療保護(hù)作用。

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