李 靜 諸 穎 張小勇 李文新 黃 慶

1 (中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 上海 201800)

2 (中國科學(xué)院研究生院 北京 100049)

碳納米材料已廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域中的納米科技研究，構(gòu)建納米藥物輸運(yùn)系統(tǒng)是碳納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。碳納米管以及修飾有各種化學(xué)分子的碳納米管復(fù)合物，能有效地被細(xì)胞攝取[1?3]。另一方面，碳納米管表面特殊的結(jié)構(gòu)，使許多化學(xué)分子或生物大分子能以共價(jià)或非共價(jià)方式連接在碳納米管上，組成碳納米管復(fù)合物。因此，碳納米管能成為一種有效的細(xì)胞內(nèi)藥物輸運(yùn)載體，一些很難穿越細(xì)胞膜的小分子藥物(多肽、蛋白質(zhì)藥物或 DNA)，可借助碳納米管有效進(jìn)入細(xì)胞，從而增強(qiáng)它們的藥效[4?6]。除載帶的藥物外，碳納米管的外壁還能修飾一些功能化基團(tuán)，如熒光素、靶向基團(tuán)等。以碳納米管為平臺(tái)構(gòu)建的納米藥物輸運(yùn)系統(tǒng)，能同時(shí)發(fā)揮多種功能，即藥物的靶向、細(xì)胞內(nèi)輸入的高效、可控或緩釋、在生命體系中可視化檢測與研究等，達(dá)到降低用藥量、增強(qiáng)藥效、減少藥物毒副作用等目的[7?9]，這是新一代復(fù)合藥物研制的重要發(fā)展方向。

近年來，納米金剛石(NDs)作為藥物載體的研究已引起關(guān)注。NDs具有化學(xué)惰性，研究結(jié)果表明，NDs對細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性，顯示出良好的生物相容性[10?12]。研究發(fā)現(xiàn)，無機(jī)分子 NaCl和 NaOH能促進(jìn)藥物在NDs上的藥物負(fù)載量[13?16]。因此，水溶性差的藥物分子能被NDs有效載帶，并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)而高效行使其生物效應(yīng)。目前已有就多種癌癥的化療劑和糖尿病治療藥物，進(jìn)行了 NDs載帶研究，每次僅載帶一種藥物分子。NDs可否成為像碳納米管那樣的同時(shí)載帶若干不同功能分子的多功能藥物輸運(yùn)系統(tǒng)，此類研究尚未見報(bào)道。本文嘗試了抗癌藥物 10-羥基喜樹堿(HCPT)、異硫氰酸熒光素(FITC)和腫瘤細(xì)胞靶向分子轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)在NDs上的負(fù)載，研究了負(fù)載多種功能基團(tuán)的金剛石復(fù)合物的細(xì)胞攝取，以及復(fù)合物對腫瘤Hela細(xì)胞的毒性，目的在于探索以 NDs為平臺(tái)構(gòu)建多功能藥物靶向輸運(yùn)系統(tǒng)的可能性。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料及其表征

采用爆炸法合成的 NDs(甘肅金石納米材料有限公司)，單顆粒尺寸2–10 nm，未經(jīng)處理直接用于實(shí)驗(yàn)。將一定量的 NDs分散在純水溶液中，超聲30 min以徹底分散，得到分散性良好穩(wěn)定的ND儲(chǔ)存液。用荷蘭 Philips公司生產(chǎn)的透射電鏡(TEM，CM120)表征100 μg/mL的NDs水溶液，紅外光譜(FT-IR，Nicolet Avatar-360)表征NDs干粉。

1.2 異硫氰酸熒光素(FITC)在NDs上的吸附

將2 mg/mL的NDs水溶液與溶解于DMSO溶液的FITC(1 mg/mL)混合，超聲10 min，室溫震蕩24 h，將混合液離心，棄上清液，清洗沉淀三次，得到FITC-ND復(fù)合物，用于吸附HCPT及TF后的熒光顯微鏡(德國Zeiss公司，Axioskop2 plus)觀察實(shí)驗(yàn)。

1.3 10-羥基喜樹堿(HCPT)在NDs上的吸附

將HCPT分散在純水中，并加入適量NaOH助溶，所得HCPT溶液(4 mg/mL, pH=8.2)與2 mg/mL的 NDs水懸液混合后，在 25℃條件下震蕩 3 d，13000 r/min離心1 h，吸出上清液待測。不含NDs的 HCPT溶液為對照組，紫外光譜儀(UV-spectra,Hitachi U-3010)掃描實(shí)驗(yàn)組和對照組在300–500 nm范圍內(nèi)的光譜，基于實(shí)驗(yàn)組與對照組在380 nm處的吸光值差異，計(jì)算HCPT在NDs上的3 d吸附量。

將制得的FITC-ND復(fù)合物分散于純水中，按上述方法吸附HCPT，制得HCPT-FITC-ND復(fù)合物備用。

1.4 轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)在NDs上的吸附

將轉(zhuǎn)鐵蛋白以 10%的終濃度，加入 HCPT-ND及HCPT-FITC-ND復(fù)合物懸液中，并短時(shí)超聲混合。為使TF充分負(fù)載于復(fù)合物上，將混合液置于25℃環(huán)境下震蕩4 h，依上述方法離心清洗分散后，得到TF-HCPT-ND及TF-HCPT-FITC復(fù)合物。

1.5 復(fù)合物TF-HCPT-ND的細(xì)胞存活率檢測

Hela細(xì)胞以105cells/mL的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)過夜，將HCPT-ND、TF-HCPT-ND復(fù)合物分散于細(xì)胞培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)要求加入24孔板，使孔中復(fù)合物終濃度達(dá)100 μg/mL(以ND計(jì))。對照組孔中加入 100 μg/mL NDs，或 50 μg/mL HCPT。此時(shí)，復(fù)合物組的HCPT劑量基本接近對照組。24 h培養(yǎng)，MTT法檢測Hela細(xì)胞24 h存活率。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.6 復(fù)合物FITC-HCPT-NDs孵育細(xì)胞后熒光鏡下觀察

NDs吸附FITC后，按前述方法吸附HCPT及TF，分別得到復(fù)合物HCPT-FITC-ND及TF-HCPTFITC-ND。Hela細(xì)胞培養(yǎng)過夜，使其充分貼壁，將兩種復(fù)合物分別加入培養(yǎng)體系中，孵育3、8、24 h后用PBS小心沖洗細(xì)胞，盡量去除未被細(xì)胞吞噬的復(fù)合物，將細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡(Zeiss，Axioskop 2)下觀察。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 表征

本文所用NDs懸浮于純水中，很易超聲分散，且不易沉降。TEM表征結(jié)果顯示(圖1a)，NDs大多以團(tuán)聚的顆粒狀存在，尺寸40–200 nm。紅外光譜表征NDs的結(jié)果如圖1(b)，所得光譜峰位與文獻(xiàn)[13]納米金剛石特征峰位一致。

圖1 納米金剛石的表征 (a)透射電鏡圖像，(b)紅外光譜Fig.1 TEM image (a) and FT-IR spectra (b) of the NDs.

2.2 NDs對HCPT吸附量測定

少量的NaOH能顯著提高HCPT的水溶解度，紫外光譜顯示，加入NaOH后HCPT在380 nm處的特征峰未被改變，所以可借此提高HCPT在NDs上的吸附[16]。紫外光譜對 NDs吸附前后的 HCPT溶液進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，吸附后的HCPT溶液吸光值明顯低于未吸附溶液(圖 2)，提示了 HCPT在NDs上的吸附。測量吸附前后樣品在380 nm處的吸光值變化，計(jì)算出HCPT在NDs上的吸附量。本文將NDs與HCPT共同混合震蕩孵育3天，得到吸附量為42.5%。同樣方法得到HCPT在FITC-ND上的吸附量為41.3%，與HCPT在ND上的吸附量差別不大。

圖2 HCPT被NDs吸附前后的紫外光譜比較Fig.2 UV-Vis spectra of HCPT before and after adsorption with NDs for 72 h.

2.3 復(fù)合物細(xì)胞存活率檢測

納米顆粒能通過不同的途徑進(jìn)入細(xì)胞，如吞噬作用、液相內(nèi)吞及受體介導(dǎo)的胞吞作用。因此，設(shè)置兩種復(fù)合物組(HCPT-ND、TF-HCPT-ND)以比較靶向基團(tuán)轉(zhuǎn)鐵蛋白的作用。細(xì)胞 MTT存活率檢測結(jié)果表明(圖3)，NDs對細(xì)胞無毒性，比較單獨(dú)藥物組HCPT及復(fù)合物HCPT-ND、TF-HCPT-ND結(jié)果，復(fù)合物組的藥效明顯高于單獨(dú)藥物組，證明了NDs吸附HCPT后，將其有效帶入胞內(nèi)發(fā)揮藥效。各組比較，毒性最強(qiáng)的是TF-HCPT-ND，提示復(fù)合物上的TF很可能與Hela 細(xì)胞表面的TF受體結(jié)合，通過 TF受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，使更多的復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組與對照組比較P<0.05；TF-HCPT-ND組與HCPT-ND組相比，存活率下降 9.03%，差異顯著(P<0.05)。

圖3 ND、HCPT、HCPT-ND、TF-HCPT-ND的24 h細(xì)胞存活率檢測Fig.3 Viability of Hela cells treated with ND, HCPT,HCPT-ND and TF- HCPT-ND for 24 h.All data were averaged from three parallel experiments.

2.4 熒光顯微鏡下觀察

FITC標(biāo)記的復(fù)合物孵育細(xì)胞后，熒光鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)如圖 4所示。由圖 4，孵育 3 h后，HCPT-FITC-ND組可見細(xì)胞輪廓及較淡的熒光，說明復(fù)合物在細(xì)胞膜上有少量粘附，而TF-HCPT-FITC-ND 組的熒光強(qiáng)度明顯高于HCPT-FITC-ND組，兩種復(fù)合物孵育細(xì)胞24 h后，鏡下觀察看到約大半細(xì)胞形態(tài)變圓，胞膜不完整，證明細(xì)胞死亡，TF-HCPT-FITC-ND組死亡細(xì)胞略多于HCPT-FITC-ND組。觀察結(jié)果與細(xì)胞存活率結(jié)果相符。

圖4 復(fù)合物TF-HCPT-FITC-ND及HCPT-FITC-ND孵育細(xì)胞不同時(shí)間后的熒光顯微鏡圖像Fig.4 Fluorescence images of Hela cells incubated with TF-HCPT-FITC-ND and HCPT-FITC-ND after incubation of different time.

3 討論

細(xì)胞存活率檢測結(jié)果表明，ND無顯著細(xì)胞毒性，單獨(dú)HCPT的毒性也較小，而藥物-納米金剛石復(fù)合物的毒性高，結(jié)果與文獻(xiàn)[16]一致，證明 ND能有效吸附HCPT并將其帶入胞內(nèi)發(fā)揮藥效。另外，載有TF的復(fù)合物毒性最強(qiáng)，說明TF發(fā)揮了靶向作用。我們選用 TF作為靶向分子，是因?yàn)樵诙喾N癌細(xì)胞表面，都存在TF受體的過表達(dá)，因此，TF能被多種癌細(xì)胞特異性識(shí)別，與 TF受體結(jié)合，激活TF受體介導(dǎo)的胞吞作用[17?19]。這為復(fù)合物的細(xì)胞攝取提供了更高效的途徑。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，TF-HCPT-FITC-ND組的熒光強(qiáng)度明顯高于HCPT-FITC-ND組，說明當(dāng)TF-HCPT-ND孵育細(xì)胞3 h后，復(fù)合物上的TF已與細(xì)胞膜上的TF受體結(jié)合，通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑，使更多的復(fù)合物進(jìn)入到胞內(nèi)。此結(jié)果與細(xì)胞存活率結(jié)果相符。

在現(xiàn)有藥物載體研究中，碳納米管[4?9,20,21]、石墨烯[22?24]、樹狀高分子[25?28]等材料均具有特殊的結(jié)構(gòu)及豐富的化學(xué)活性(表層分布的大量的官能基團(tuán))，利用這些化學(xué)性質(zhì)可將多種藥物和其他功能基團(tuán)修飾上去，使它們成為多功能的藥物載體。納米金剛石修飾多種基團(tuán)的工作尚處于起步階段[29?32]，可能是因?yàn)榧{米金剛石的化學(xué)惰性，使其多功能基團(tuán)的同時(shí)修飾相當(dāng)困難，NDs的多基團(tuán)修飾需另辟蹊徑。

我們在NDs吸附多種分子的初期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其對不同大小的分子吸附行為的差異較大，如細(xì)胞全培養(yǎng)液中的蛋白類分子BSA在NDs上的吸附1 h即達(dá)平衡，而較小藥物分子HCPT至少需5天才能達(dá)到平衡。由此提出如下的NDs吸附模型：當(dāng)NDs分散于培養(yǎng)基中，形成了團(tuán)聚，這些團(tuán)聚物具有與外界相通、尺寸不一的納米通道或小孔，當(dāng)小分子藥物(如HCPT)與NDs團(tuán)聚物接觸后，慢慢進(jìn)入團(tuán)聚物內(nèi)部的孔道中，故HCPT在NDs上充分負(fù)載需較長時(shí)間，吸附量也相對較高；而BSA類的蛋白質(zhì)分子因分子大而不能進(jìn)入孔道，則更多地被吸附在團(tuán)聚物表面，故短時(shí)間內(nèi)即達(dá)平衡。

根據(jù)這種團(tuán)聚物的特殊空間構(gòu)型及對多種分子較強(qiáng)的吸附能力，我們設(shè)想，NDs有可能以不同于碳納米管、氧化石墨烯和樹狀高分子的機(jī)制來組裝復(fù)合藥物輸運(yùn)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)基于所提出的假設(shè)，讓較小的分子先進(jìn)入納米金剛石團(tuán)聚物內(nèi)部，大的分子吸附在外部，從小到大按層組裝藥物復(fù)合系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)證明，此復(fù)合系統(tǒng)具有藥物活性、熒光及靶向功能，且藥效也提高了，證明了我們提出假設(shè)的合理性和可靠性。

本文基于納米金剛石的團(tuán)簇多孔特性，成功組裝具有多種功能的納米金剛石復(fù)合藥物輸運(yùn)系統(tǒng)，達(dá)到預(yù)期效果，開創(chuàng)了納米金剛石藥物輸運(yùn)系統(tǒng)的研制新途徑。

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