杜景霞,李 艷,王建剛,路西明,金滿文

白藜蘆醇(RES)是一種非黃酮類(lèi)多酚化合物,化學(xué)名為3, 5, 4' -三羥基-反-二苯代乙烯(3, 5, 4' -trihydroxystilbene)。天然的RES存在于葡萄皮、花生及中藥虎杖等72種植物中,是一種植物抗毒素,在惡劣環(huán)境或是在植物受到霉菌感染時(shí)產(chǎn)生[1]。紅葡萄酒可以顯著降低心腦血管病發(fā)生率,使人們對(duì)紅葡萄酒中的多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了廣泛而深入的研究。目前越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為, RES是紅葡萄酒中發(fā)揮心血管保護(hù)作用的主要功能因子。研究證實(shí),RES能夠比紅葡萄酒中的其他多酚類(lèi)物質(zhì)具有更強(qiáng)的心血管保護(hù)作用[2],包括抗氧化、抑制血小板聚集、增加eNOS和nNOS的表達(dá)并提高其活性、舒張血管、抗血管平滑肌細(xì)胞增殖、抑制血管緊張素II引起的心肌細(xì)胞肥大、抗心律失常等作用[3-7]。也有報(bào)道RES對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞鈣電流的快速抑制作用[8]。三甲基白藜蘆醇(TMS)是RES的衍生物,研究發(fā)現(xiàn)TMS也具有類(lèi)似于RES的一些藥理作用,如抗血管增殖[9]、抗炎抗過(guò)敏[10]、抗腫瘤[11]等作用。鑒于RES和TMS在化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用上的相似性, TMS可能更具應(yīng)用前景。本研究探討RES對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞INa是否有直接的作用,并觀察TMS是否也具有和RES相似的作用,并比較其作用強(qiáng)弱,進(jìn)一步探討其心肌保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 溶液和試劑Tyrode液成分(mmol/L):NaCl 135, KCl 5.4, CaCl21.8, MgCl21.0, NaH2PO40.33,Glucose 10.0, HEPES 10.0, 用 NaOH調(diào)節(jié) pH至7.3。無(wú)鈣臺(tái)氏液為T(mén)yrode液中去掉 CaCl2。記錄INa的電極外液(mmol/L):NaCl 5.0, Choline-Cl 120.0, CsCl20.0, MgCl21.0, HEPES 5.0, CaCl21.0,Glucose 10.0, 用 CsOH調(diào)節(jié) pH至 7.3, 加入 100 μmol/L CdCl2阻斷Ca2+電流。記錄INa的電極內(nèi)液(mmol/L):NaCl 5.0, CsCl 110.0, CsF 20.0, MgCl22.5, Cs-EGTA 5.0, HEPES 5.0, Mg-ATP 5.0, GTP 0.1,用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.3。保存細(xì)胞用的KB液成分(mmol/L):KCl 10.0, KH2PO410.0, Glucose 20.0, HEPES 10.0, Taurine 10.0, MgSO41.8,Potassium glutamate 120.0, EGTA 0.5,用KOH調(diào)節(jié)pH至7.2。RES從湖南洪江華光生物有限責(zé)任公司購(gòu)進(jìn),純度99.11%。 TMS由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院食品藥品評(píng)價(jià)中心合成,純化分離,純度99.9%。臨用前均用二甲基亞砜(DMSO)溶解,分別配置成儲(chǔ)備液濃度為0.1 mol/L和0.01 mol/L, -20℃避光保存。臨用前稀釋至少1 000 倍。膠原酶II型和蛋白酶E購(gòu)自 Worthington公司。 HEPES, BSA, EGTA,choline-Cl, Taurine, Mg-ATP, GTP均為Sigma公司產(chǎn)品。其余藥品為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 豚鼠心室肌細(xì)胞分離采用酶解法制備單個(gè)心室肌細(xì)胞。體質(zhì)量280 ～330 g的豚鼠,雌雄不拘,經(jīng)20%氨基甲酸乙酯(120 mg/kg)腹腔麻醉后行氣管插管,開(kāi)胸,下腔靜脈給予肝素500 U/kg,分離主動(dòng)脈并插管,肺動(dòng)脈減壓,迅速取下心臟在37℃恒溫和供氧(100%O2)條件下行Langendorff灌流(主動(dòng)脈壓70 cm水柱)。先以Tyrode液灌流3 min,再以無(wú)鈣臺(tái)氏液沖洗3 min后, 用含II型膠原酶10.5 mg,蛋白酶E 1.05 mg, BSA 25 mg的無(wú)鈣臺(tái)氏液25 m L循環(huán)灌流35 ～40 min,取下心臟,除去心房,取一小塊左室心肌,稍剪后置于KB液中輕輕吹打至細(xì)胞分離,即得到分離的單個(gè)心室肌細(xì)胞。細(xì)胞放于4℃保存,靜置1 ～2 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄采用全細(xì)胞膜片鉗記錄方法,在電壓鉗制下記錄心室肌細(xì)胞INa。吸取細(xì)胞保存液數(shù)滴,加入1 mL細(xì)胞池內(nèi),待細(xì)胞沉底貼壁后,用細(xì)胞外液灌流,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束停止灌注。在倒置顯微鏡下選擇橫紋清晰無(wú)顆粒感,膜光滑完整,立體感強(qiáng)的桿狀靜止細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。 INa記錄在20℃左右完成。玻璃毛坯(外徑1.5 mm,南京泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠),經(jīng)微電極拉制儀(Sutter, Japan)兩步拉制后,尾端注射充灌電極內(nèi)液。將電極固定于電極把持器上,通過(guò)把持器側(cè)面吸管給予電極尖端一定正壓并使其進(jìn)入液面,入水電阻為1.0 MΨ左右。補(bǔ)償液接電位后,調(diào)節(jié)三維操縱器并用微調(diào)將電極尖端移向細(xì)胞表面,放掉正壓,輕施負(fù)壓進(jìn)行封接,使封接電阻達(dá)1 GΨ以上,即形成高阻封接。補(bǔ)償CFast后,繼續(xù)施加脈動(dòng)負(fù)壓穿破膜片形成全細(xì)胞記錄模式。鉗制電位-100 mV,補(bǔ)償串聯(lián)電阻Rs(記錄INa的Rs<2.5 MΨ,值穩(wěn)定)和CSlow,以減少鉗位誤差和記錄信號(hào)的失真。通過(guò)膜片鉗放大器(HEKA, EPC-10, Germany)發(fā)放刺激沖動(dòng),激發(fā)的電流信號(hào)經(jīng)AgCl-Ag電極引導(dǎo)、放大器放大,由A/D轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào),存于硬盤(pán)中以備分析。電流信號(hào)經(jīng)截止頻率2.9 kHz的四階貝塞爾低通濾波,采樣頻率5 kHz。

1.4 數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)資料采用PULSE+PULSEFIT軟件包測(cè)定, 資料分析和圖表處理采用 Excel和Sigma Plot軟件。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

圖1 DMSO對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞INa的影響

2 結(jié)果

2.1 豚鼠心室肌細(xì)胞INa隨時(shí)間變化的特點(diǎn)形成全細(xì)胞模式后,在電壓鉗模式下,保持電位-130 mV,給予幅值-35 mV,時(shí)程40 ms的去極化刺激引出一內(nèi)向電流INa。連續(xù)觀察50 min內(nèi)豚鼠心室肌細(xì)胞INa的變化(圖1)?？梢?jiàn)從破膜后13 min至50 min電流處于穩(wěn)定狀態(tài),給藥及洗脫均在這段時(shí)間內(nèi)完成。

2.2DMSO對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞INa的影響DMSO用鈉外液稀釋1 000倍后持續(xù)灌注細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)方法同上,可以看出DMSO對(duì)INa沒(méi)有任何影響(圖1)。

2.3RES濃度依賴性的抑制豚鼠心肌細(xì)胞INa 實(shí)驗(yàn)方法同上,觀察RES(10, 30, 100 μmol/L)對(duì)心室肌細(xì)胞INa的作用。發(fā)現(xiàn)RES(30, 100 μmol/L)濃度依賴性的降低INa峰值,抑制率分別為(17.3±3.1)%(P<0.005), (52.7 ±10.2)%(P<0.01)(圖2)。抑制作用快,發(fā)生在給藥后的3 min左右,其中30 μmol/L抑制作用在給藥后的7 min左右達(dá)到最大,而100 μmol/L抑制作用在給藥后的10 min左右達(dá)到穩(wěn)態(tài)。洗脫后均可以完全恢復(fù)。

2.4TMS對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞INa的影響實(shí)驗(yàn)方法同上,觀察TMS(1, 3, 10 μmol/L)對(duì)心室肌細(xì)胞INa的作用。發(fā)現(xiàn)10 μmol/L TMS降低INa峰值,作用快(3 min左右), 10 min時(shí)抑制率為36.8±5.6%(P<0.005),洗脫后可完全恢復(fù)。 1、3 μmol/L對(duì)INa沒(méi)有明顯的抑制作用(圖3)。

2.5RES對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞INa電流-電壓曲線(IV曲線)的影響保持電位-130 mV,以5 mV的階躍,給予(-80 ～+15)mV,時(shí)程40 ms,頻率0.1 Hz的去極化脈沖,得到鈉電流的I-V曲線。本實(shí)驗(yàn)條件下,豚鼠心室肌細(xì)胞的最大激活電壓在-30 mV左右,加入RES 100 μmol/L 8 min后,最大激活電壓不變,但各電壓條件下的INa峰值均降低, 在-30 mV, INa從給藥前的(-16.36±3.75)pA/pF降低到(-8.40±2.04)pA/pF(圖4)。

2.6TMS對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞INa電流-電壓(I-V)曲線的影響保持電位-130 mV,以5 mV的階躍,給予(-80 ～+15)mV,時(shí)程40 ms,頻率0.1 Hz的去極化脈沖,得到INa的I-V曲線。本實(shí)驗(yàn)條件下,豚鼠心室肌細(xì)胞的最大激活電壓在-30 mV左右,加入TMS 10 μmol/L 8 min后,最大激活電壓不變,但各電壓條件下的INa峰值均降低,在-30 mV, INa從給藥前的(-13.31 ±3.6)pA/pF降低到(-9.49±3.27)pA/pF(圖5)。

3 討論

在神經(jīng)、心臟和骨骼肌等可興奮組織,細(xì)胞膜上的鈉通道在跨細(xì)胞膜動(dòng)作電位的除極化過(guò)程中執(zhí)行著傳導(dǎo)鈉離子電流的功能。鈉離子通道活動(dòng)異常將會(huì)導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生,如在心臟,鈉離子通道活動(dòng)紊亂,會(huì)影響心肌的電生理特性,出現(xiàn)心律失常等嚴(yán)重后果。很多藥物都是通過(guò)影響鈉離子通道而發(fā)揮治療作用的,如I類(lèi)抗心律失常藥、局麻藥及某些抗癲癇藥等。

心肌細(xì)胞膜上存在著大量的鈉-鈣交換體(INa/Ca),它是一種雙向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,正常狀態(tài)下,鈉-鈣交換電流以內(nèi)向電流為主,使細(xì)胞內(nèi)鈣離子外排,這是維持胞內(nèi)鈣離子濃度的重要機(jī)制之一。INa/Ca對(duì)細(xì)胞內(nèi)Na+濃度的變化十分敏感。心肌細(xì)胞內(nèi)Na+濃度的升高促使INa/Ca反向轉(zhuǎn)運(yùn),導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流,并由此誘發(fā)肌漿網(wǎng)釋放Ca2+,最終使得胞內(nèi)Ca2+增加[12],致胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的破壞。

胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的破壞在再灌注損傷的發(fā)展中起重要作用[13]。缺血再灌注時(shí)使心肌細(xì)胞恢復(fù)正常的鈣穩(wěn)態(tài), 攣縮帶壞死和梗死面積均可受到抑制。TMS是RES的甲基化衍生物,結(jié)構(gòu)相似。 RES在心血管方面的保護(hù)作用已深為人知,而對(duì)TMS的心血管保護(hù)作用卻知之甚少。

本研究結(jié)果表明RES(10, 30, 100 μmol/L)濃度依賴性的抑制豚鼠心室肌細(xì)胞INa,對(duì)INa的抑制率分別為(6.7 ±2.7)%、(17.3 ±3.1)%和(52.7 ±10.2)%。本研究也發(fā)現(xiàn)TMS對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞INa具有類(lèi)似于RES的快速抑制作用,洗脫后也可完全恢復(fù),且藥效顯著強(qiáng)于RES, 10 μmol/L TMS對(duì)INa抑制率為(36.8±5.6)%, 1、3 μmol/L對(duì)INa抑制率分別為(5.5±0.9)%、(4.7±0.7)%。先前的研究已證實(shí)甲基化衍生物TMS某些方面作用強(qiáng)于RES,如抗血管增殖、抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤等,我們的研究更進(jìn)一步證實(shí)了此作用?？梢?jiàn),甲基化衍生物TMS比RES更具有潛在的心肌保護(hù)作用。

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