李宜川 張玉霞 劉國玲 高明燦 常景芝 沈永杰 陳曉琦

河南商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物化學(xué)教研室(商丘 476100)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumation Arth ritis,RA)是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病,其顯著的病變以滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤、滑膜細(xì)胞增生、血管翳形成和軟骨及軟骨下骨質(zhì)破壞為主要病理表現(xiàn)。RA的發(fā)病機(jī)制涉及細(xì)胞因子、遺傳、感染等多種因素,其中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡在 RA的發(fā)生、炎癥遷延、關(guān)節(jié)的破壞中占有重要的地位[1]。白芍總苷(total glucosides of paeonia,TGP)是從亳白芍干燥根中提取的有效成分,主要為糖苷類物質(zhì),具有多途徑抑制自身免疫反應(yīng),以及抗炎、止痛、抗應(yīng)激等作用。本實(shí)驗(yàn)在成功地建立膠原性關(guān)節(jié)炎(co llagen-in-duced arth ritis,CIA)大鼠模型的基礎(chǔ)上,觀察 TGP對(duì) CIA大鼠的治療作用,通過檢測(cè)大鼠血清中LI-1β、 TN F-α、IL-4和 IL-10水平及關(guān)節(jié)浸液中 NO和 PGE2含量,探討 TGP對(duì) CIA大鼠治療的可能機(jī)制,為臨床使用TGP治療 RA提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法 1.1 材料 TGP:購于安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所;弗氏完全佐劑、雞Ⅱ型膠原(chicken type II collagen,C II):上海本草生物醫(yī)學(xué)工程所提供;多聚賴氨酸:Sigma公司;地塞米松鹽酸注射液 (5mg/m L):河南確山龍淵藥家莊四藥股份有限公司;LI-1β、TN F-α、IL-4和 IL-10試劑盒 RD公司;NO試劑盒:南京建成生物工程研究所;PGE2試劑盒、:解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所;酶標(biāo)免疫測(cè)定儀:Bio-Rad公司;80-2型離心機(jī):蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司。

Sp rague-Daw ley(SD)大鼠 60只 ,雌雄各半 ,質(zhì)量 (180±20)g左右,動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):2010A01。

1.2 方 法 1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:實(shí)驗(yàn)用大鼠按統(tǒng)計(jì)學(xué)方法隨機(jī)分為 6組:A正常組對(duì)照組,B模型對(duì)照組,C地塞米松組(2mg/kg),D白芍總苷小劑量組(25mg/kg),F白芍總苷中劑量組(50mg/kg),E白芍總苷大劑量組(100mg/kg)。每組 10只。

1.2.2 CIA大鼠模型的制作及給藥方法:將雞Ⅱ型膠原15mg制成穩(wěn)定的乳化劑 15m L,每 m L含 1.0gⅡ型膠原,置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。SD大鼠,除正常對(duì)照組外,以 0.1m L/只的劑量在鼠的左后肢足跖皮內(nèi)注射膠原乳劑致炎,第 7d在大鼠尾、背多點(diǎn)皮內(nèi)注射 0.1m L該膠原乳劑作為激發(fā)注射。正常對(duì)照組注射等劑量生理鹽水作為致炎物質(zhì)。于造模后第 7～27d各用藥組灌胃給藥,1次 /d,正常對(duì)照組和模型組用等容積生理鹽水灌胃。

1.2.3 血清細(xì)胞因子測(cè)定:實(shí)驗(yàn)第 36d向 CIA大鼠腹腔內(nèi)注射 3%巴比妥那 0.3～ 0.4m L使之麻醉。剪開大鼠腹腔,心臟取血,3000rpm離心 15m in,吸取上層血清。用 ELISA法 (按試劑盒說明書進(jìn)行操作)測(cè)定 CIA大鼠血清中 LI-1β、TNF-α、IL-4和 IL-10含量。

1.2.4 關(guān)節(jié)浸液 NO和 PGE2的測(cè)定:大鼠處死后,迅速在左足摘取腫脹足爪,縱向切開足爪組織,放入冷生理鹽水中,于 4℃浸泡過夜,離心取上清液過濾除菌。NO含量的測(cè)定采用硝酸還原法,PGE2含量測(cè)定采用放免法,均按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)分析用 SPSS11.5軟件處理,數(shù)據(jù)以 x-±s表示,計(jì)量資料的組間顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果 2.1 TGP治療前 CIA大鼠各組血清 LI-1β、TN F-α、IL-4和 IL-10水平比較造模后,TGP給藥治療之前,CIA大鼠血清 LI-1β、TNF-α水平較正常組大鼠異常增高(P＜0.01),IL-4和 IL-10含量有所下降,但與正常組大鼠比較無顯著性差異(P＞ 0.05),見表1。

表1 治療前 CIA各組大鼠 LI-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平比較,(pg/m L,n=10±s)

表1 治療前 CIA各組大鼠 LI-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平比較,(pg/m L,n=10±s)

注:各組與正常組比較,△P＜0.01。

正常對(duì)照組13.28± 3.4514.21± 6.529.20± 0.7932.86± 6.11模型對(duì)照組33.16±4.12△32.98± 6.87△7.73±1.1231.10±4.12 2mg/kg的地塞米松組32.65±4.10△32.58± 3.46△8.30±1.8830.43±1.52 25mg/kg白芍總苷組33.89±5.13△33.19± 1.87△8.41±1.4430.63±3.89 50mg/kg白芍總苷組31.73±4.37△33.15± 4.89△7.76±1.8931.47±2.86 100mg/kg白芍總苷組33.13±3.98△32.88± 1.15△7.69±2.1030.88±3.12

表2 TGP治療后血清 LI-1β、TNF-α、IL-4和 IL-10水平與 CIA對(duì)照組的比較,(pg/m L,n=10,±s)

表2 TGP治療后血清 LI-1β、TNF-α、IL-4和 IL-10水平與 CIA對(duì)照組的比較,(pg/m L,n=10,±s)

注:與模型組比較,△P＜0.01。

組 別LI-1βTNF-αIL-4IL-10模型對(duì)照組34.28± 5.7631.78± 4.737.51.± 1.7824.12± 3.57 2mg/kg的地塞米松組22.48±3.16△22.43± 5.44△33.12±2.10△49.88±8.45△25mg/kg白芍總苷組33.49± 4.8830.10± 2.118.48± 4.3425.44± 6.87 50mg/kg白芍總苷組24.36±5.66△23.62± 4.23△33.22±3.18△50.22±2.78△100mg/kg白芍總苷組23.39±4.32△25.46± 1.53△32.20±2.33△51.41±2.43△

2.2 TGP治療后血清 LI-1β、 TN F-α、 IL-4和 IL-10水平與 CIA大鼠對(duì)照組的比較 TGP(50,100mg? kg-1)組及地塞米松(2mg? kg-1)組治療后 CIA大鼠血清 LI-1β和TN F-α水平明顯降低,IL-4和 IL-10水平明顯上升,與 CIA大鼠模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01),見表2。

2.3 TGP對(duì) CIA大鼠關(guān)節(jié)浸液內(nèi) NO和 PGF2含量的影響 與正常組比較模型組大鼠關(guān)節(jié)浸液中 NO和 PGE2含量明顯增高 (P＜0.01);TGP(50,100mg? kg-1)組、地塞米松(2mg? kg-1)組和 TGP(25mg? kg-1)組治療后關(guān)節(jié)浸液內(nèi)NO、PGE2含量下降,與模型組大鼠比較有顯著性差異 (P＜0.01,P ＜ 0.05)。 見表3。

表3 白芍總苷對(duì) CIA大鼠關(guān)節(jié)浸液內(nèi) NO和PGF2含量的影響,(n=10,±s)

表3 白芍總苷對(duì) CIA大鼠關(guān)節(jié)浸液內(nèi) NO和PGF2含量的影響,(n=10,±s)

注:與正常組比較 ,△P＜0.01;與模型組比較▲P＜0.01,◇P ＜0.05。

正常對(duì)照組19.88±8.598.87± 6.46模型對(duì)照組47.25±7.22△32.77±9.88△2mg/kg的地塞米松組30.12± 11.46▲15.13±2.16▲25mg/kg白芍總苷組37.22± 12.10◇20.11±1.16◇50mg/kg白芍總苷組28.42± 11.31▲15.66±3.44▲100mg/kg白芍總苷組26.88±2.19▲14.18±6.23▲

討 論 RA病因和病理機(jī)制還不十分明確,但越來越多的證據(jù)表明,細(xì)胞因子在 RA的病理過程中發(fā)揮著重要作用[2]。TN F-α是由 Mф衍生的細(xì)胞因子,具有多種促炎作用,在滑膜細(xì)胞培養(yǎng)液中 TNF-α可刺激膠原酶和前列腺素 E的產(chǎn)生,導(dǎo)致軟骨和骨骼損害[3],TN F-α還能上調(diào)粘附分子在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)和其它炎性細(xì)胞因子如 LI-1β、LI-6和 GM-CSF等的產(chǎn)生[4]。 IL-1β可誘導(dǎo) RA關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖,刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生蛋白激酶,增強(qiáng) TN F-α和 IL-6的效應(yīng)。 IL-10是一種天然的免疫抑制劑,可減少致病性促炎性細(xì)胞因子和趨化因子,抑制LI-1β和 TN F-α的產(chǎn)生,IL-10還能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)及提高金屬蛋白酶組織抑制因子的表達(dá),從而產(chǎn)生對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。 IL-4由 T細(xì)胞衍生,可阻礙破骨細(xì)胞前體轉(zhuǎn)化為破骨細(xì)胞,降低破骨細(xì)胞活力,抑制其存活。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),CIA大鼠血液 LI-1β、TN F-α水平升高,TGP治療后血液LI-1β和 TNF-α含量均明顯下降,水平低下的 IL-4和 IL-10含量側(cè)明顯升高,提示 TGP可能通過直接或間接作用降低 LI-1β和 TNF-α的產(chǎn)生 ,提高血液 L-4和 IL-10含量,從而對(duì) CIA大鼠發(fā)揮治療作用。

RA動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎時(shí) ,體內(nèi) NO水平異常升高,特別是關(guān)節(jié)浸液中有大量 NO[5]。作為一種重要炎癥介質(zhì) NO損害關(guān)節(jié)的機(jī)制是促進(jìn) PGE2、LI-1β和 TN F-α等炎癥介質(zhì)的釋放,導(dǎo)致血管過度擴(kuò)張、滲出增多[6]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn) CIA大鼠關(guān)節(jié)浸液中 NO和 PGE2含量明顯增高;TGP治療后 CIA大鼠關(guān)節(jié)浸液中 NO和 PGE2水平顯著低下。提示 TGP可通過抑制關(guān)節(jié)浸液 NO和 PGE2產(chǎn)生,減輕局部炎癥,改善關(guān)節(jié)腫脹等癥狀。

綜上所述,TGP對(duì) CIA大鼠的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎其機(jī)制可能是 TGP抑制 CIA大鼠內(nèi)源性細(xì)胞因子 (LI-1β和 TN F-α)活性和炎癥局部區(qū)域相關(guān)炎癥介質(zhì)(NO和 PGE2)產(chǎn)生,同時(shí)提高抑炎細(xì)胞因子(L-4和 IL-10)含量,誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)趨于平衡,從而對(duì) CIA大鼠發(fā)揮治療作用。

[1] M arc Feldmmm.Role o f cy tokines in rheumatoid arthritis[J].Ann.Rev.Immunol,1996,14:397.

[2] Arend W P,Dayer JM.Inhibition of the produc tion and effects of Interleukin-1 and tumor necrosis factor a in meumatoid arthritis[J].Arth ritis Rhetum 1995,38:151-160.

[3] Feldmam M,Breman FM.,Maini RN.Role of cytokimes in rheumatoid arthritis[J].Ann Rev Immunol,1996,21:2575-2579.

[4] 呂麗萍 ,張永忠.雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的影響[J].中成藥,2007,29(7):966-968.

[5] 王 斌,陳敏珠.一氧化氮與炎癥性關(guān)節(jié)疾病 [J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,1999;3(3):191.

[6] Xia LJ,ChenF H,RenB,et a1.Efect of recombinant human endostatin on pro liferation and cy tokines produc tion of synoviocytes from adjuvant arthritis rats in vivo[J].Chin Pharmao～l Bu ll,2007,23(1):59-63.